光固化生物3D打印可打印性评价标准及打印过程模型

Biofabrication modeling printability.pdf

投影式光固化生物3D打印技术（DLP）近年来已有成为主流生物3D打印方法的趋势。相比其他生物打印方式，DLPBP具有三点显著的优势：1.以二维平面为基本单元构成实体（以面成体）的快速性；2.理论上可达微米级别的超高打印分辨率；3.可同时打印数个模型拷贝带来的极高的生产效率与可重复性。其中，快速性保证了含细胞生物墨水打印的过程耗时短，减少打印过程对细胞的影响；高精度高分辨率使其具有构建几乎所有生物器官模型的制造能力；而极高的生产效率与可重复性则在后续应用中具有非常重要的工程意义：对于药物筛选、动物实验等，都需要大量且重复性好的打印样本，才能确保研究结果的可靠性。

然而，利用DLP技术进行生物打印也有着明显的局限性，即所用的材料必须同时具有可光交联性、一定的力学性能与良好的生物相容性。兼具上述需求的材料已是相当稀少，而在这些材料中，有很大比例也仅是在某一方面甚至两方面勉强达标。这大大限制了DLP在生物制造领域的应用。

2016年我们发表了关于挤出式生物3D打印可打印性评价研究的工作，很开心国内外同行对我们工作比较认可，目前这篇文章已被引252次（GoogleScholar数据，Research on the printability of hydrogels in 3D bioprinting. Scientific reports, 2016, 6: 29977），后续的很多挤出式生物3D打印墨水性能评估、打印质量评价等都参考了我们的工作。考虑到投影式光固化生物3D打印会越来越重要，我们觉得有必要构建起打印过程标准，深入理解影响其打印质量的关键所在。

为此我们在系统掌握GelMA基生物墨水特性的基础上，探讨了如何提升投影式光固化生物3D打印的质量，建立了可打印性评价标准，构建了打印过程模型，实现了生物墨水的高精度打印，并可通过工艺参数的调控来模拟不同人体软组织的力学性能（图1）。相关研究成果Modeling the printability of photocuring and strength adjustable hydrogel bioink during projection-based 3D bioprinting， （doi: 10.1088/1758-5090/aba413）发表在Biofabrication杂志上，孙元博士为一作，贺永教授为通讯作者。

图 1利用投影式光固化生物3D打印（EFL-BP8600）进行生物墨水的高精度打印，并可通过工艺参数的改变来模拟不同人体软组织的力学性能

在本研究中，我们选取了GelMA水凝胶材料作为生物墨水。GelMA兼具上述三种性能，因其组成与细胞外基质（ECM）几乎相同生物性能尤其优异，且可在LAP引发剂+可见蓝光的组合下在几秒内快速交联成形。然而GelMA质地软，力学性能较差，导致其在打印过程中易变形或断裂，很难用纯GelMA材料打印出复杂的模型。同时，GelMA这类生物大分子的交联过程难以量化描述，控制打印性是一大难点。

作者首先建立了大分子生物材料的光交联模型，基于能量累积的理论基础建立了光固化的数学模型。随后，根据DLP打印的特性，将打印精度分为成形面内（xy平面）精度与层面间（z方向）精度。分别通过理论与实验研究给出了提高打印性的通用标准方法。

在z方向上（图2），根据光衰减模型与实验计算得到的交联能量阈值，分析得到了交联厚度与光吸收剂浓度之间的关系。给出了实验获得最适曝光深度对应的吸收剂浓度的一般方法。

图 2  z方向打印精度优化

在xy面内（图3），作者给出了评价其打印精度的标准模型及方法。并研究了打印参数中，浓度与曝光时间对xy平面内精度的影响。

图 3  用于评价xy面内打印精度的标准模型与打印优化结果

除打印性能外，为解决水凝胶力学性能差的问题，作者通过调整GelMA的合成过程，获取了一系列取代率不同的GelMA材料，并通过改变材料浓度与打印时间，获得了从0.1kPa到10³kPa跨越4个数量级的杨氏模量可控可调范围（图4），而这几乎包含了人体中所有软组织的分布区间，并覆盖到部分软骨的区域。经过大量实验分析，作者给出了这三个控制变量对强度与模量两个主要力学性能参数的影响规律。通过数据拟合，给出了力学性能图谱，可根据需要的强度与模量，在图上找到对应的打印工艺参数（图5）。

图 4  GelMA取代率、浓度、曝光时间对力学性能的影响规律

图 5  拉伸模量与强度MAP，同时获得指定的模量与强度所对应的三种打印参数

在打印行提高且力学性能可控的基础上，作者对打印结构的生物性能做了一系列测试（图6）。以血管内皮细胞HUVECs为例，作者验证了带细胞打印/支架黏附细胞两种条件细胞的活力与功能。共聚焦照片显示细胞的形态与功能表达都较为理想。

图 6  HUVECs为例的打印结构生物性能

最终，作者以分叉血管为例，展示了其研究成果用于打印复杂器官模型、力学性能可控、生物性能优异的应用潜力（图7）。作者打印了一根外径不足1mm，壁厚100um，长6mm的分叉血管，优化后的打印工艺使得打印的结构通畅无阻、管壁完整。血管模型的拉伸模量为127kPa，与预设的120kPa十分接近。内皮细胞可增殖并铺满于整个内腔，形成单层的内皮细胞层。

图 7  高精度分叉血管打印应用案例

此研究可为研究人员提供了一种标准化的提升生物墨水一致性的方法，也为药物筛选、组织工程、再生修复等领域的研究者提供了一种制造结构复杂、力学性能可控、可重复性高、生物相容性好的模拟组织/支架的实用方法。

论文链接：https://doi.org/10.1088/1758-5090/aba413