微生物多样性测序（扩增子测序）是基于二代高通量测序对16S/18S/ITS等序列进行测序。可以同时检测样本中的优势物种、稀有物种及一些未知物种的检测，获得样本的微生物群落组成以及相对丰度。

相信关注我们的小伙伴对此并不陌生。

这次我们整合了大家平时会遇到的一些问题，在原有的基础上对报告进一步完善。

报 告 全 新 升 级 

想知道总体结果？先看这

——项目概述

重要指数 :★★★★★

这部分内容必看。

主要是汇总信息，包括样本数据量，测序质量，重复性效果评估，分组信息，组间差异评估，代谢途径上差异，功能预测等。

这里会给出本项目中的一些重要提示，帮你从众多的报告信息中获取关键的部分。

实验、分析流程怎么写？

——技术介绍

重要指数 :★★★

技术介绍这部分内容，就是说我们基于是怎么样一个测序平台、什么方法来获得的最后的数据。

如果你担心  

这么直观的报告，

会不会不够详细？

小问号里有宝藏！

如上图，点击实验流程旁边的小问号，弹出的文件夹里就有详细的英文版方法介绍。

数据质量怎么样  

——OTU/ASVs结果统计 

重要指数 :★★★★

这部分内容主要是数据统计的图表：

Raw-tags：  样本的原始序列数据

Singleton： 无完全匹配的单条序列数量

tagsmatchedASVs： 比对到最终ASVs的序列数据

ASVs：以及ASVs的种类个数

参数自由选择，图片灵活生成

——物种注释及构成

重要指数 :★★★★

经过SILVA138数据库的注释，得到ASVs的物种注释结果。

这一部分可以看到每个样本的物种构成比例，Taxonomic Level 可以选择Level1 ~ Level7 界门纲目科属种，不同分类水平下的物种构成。

这里选择level2就是“界”层级（可根据需求自选），另外比如选一个groups分组，如下：

柱状图太宽？太窄？

一拉即可调整！

同时给出了各分类水平的相关原始数据，可以到对应路径进行查看。

表格任意排序，3D动图自由切换

——多样性分布结果

重要指数 :★★★★

α多样性

评估单个样本内的物种构成的丰度情况

使用Qiime2进行α多样性分析，分别计算获得simpson，ace，shannon，chao1以及goods_coverage数据统计结果。

β多样性

通过降维的方法来考察样本与样本之间的相似度和关系，种属构成特征。

三种聚类方式：

Beta多样性PCA、非加权距离的PcoA、加权距离的PcoA的3D图。

按住鼠标随意拖动，可以看到任意角度的三维坐标自由变换。

大小可自行调整

多色系任你挑选

总有你想要的图

分组统计分析，更懂你想要的

重要指数 :★★★★★

按照你填写的样本信息单，对各分组情况，进行统计学差异分析。

分组Venn图

OTU/ASVs比较韦恩图（样本数/分组数<=5个样本，若分组数大于5出花瓣图）

分组元信息统计

对分组样本及其元数据进行统计

α多样性

分组之间alpha多样性指数使用非参数统计检验

分组是否有意义？——β多样性

Beta多样性分组Anosim检验结果

Anosim分析是一种非参数检验，用来检验组间的差异是否显著大于组内差异，从而判断分组是否有意义。

要PCA结果图？

要PCoA结果图？

要NMDS结果图？

要加权？非加权？

... ...

全部都有

Beta多样性PCA结果

使用bray_curtis的PCA组间分布及差异

Beta多样性非加权PCoA结果

使用unweighted_unifrac的PCoA组间分布及差异

Beta多样性加权PCoA结果

使用weighted_unifrac的PCoA组间分布及差异

Beta多样性NMDS结果

非度量多维尺度分析 NMDS 分析与 PCoA 类似，也是一种基于样本距离矩阵的分析方法，通过降维处理展现样本特定的距离分布。

通过对样本距离进行等级排序，使样本在低维空间中的排序尽可能符合彼此之间的距离远近关系（而非确切距离数值）。因此，NMDS 分析不受样本距离的数值影响，对于结构复杂的数据排序结果可能更稳定。

你想要的层级或分组都有——组间物种构成柱状图

样本及分组之间聚类热图

了解样品之间的相似性以及属水平上的群落构成相似性。

组间各物种分类水平及功能差异

Tukey检验

如果样本每个分组是完全均等的情况（比如说每个组各有10个样），适合用Tukey检验。

优势：

可以快速在图中表现出多个分组之间，哪两个之间存在显著差异。

组间各物种分类水平 

非参数检验

各个层级均有相对应的图展示。

组间菌群比较选取物种标志物

Lefse分析

基于线性判定的方式，筛选组与组间的生物标记物——也就是说找到组间存在特别显著的高丰度的菌属。

Bugbase菌群表型特征功能预测分析

基于文献的一些分类，对菌属进行菌群表征，包括对厌氧/好氧，革兰氏阴性/阳性，生物膜形成等分类。

环境样本工具？——FAPROTAX生态功能预测

整合文献原核功能数据库，偏向于代谢和生物学功能的注释。比较适合环境样本，比如说碳、氢、氧、氮、硫等元素的代谢循环的能力。

基因功能预测？——Picrust2功能预测分析

随着研究的不断深入，很多菌的基因组数据有了，基于基因组数据一旦能确定其物种来源，可以推测它具有的基因的拷贝数、代谢通路的构成特征。

2万多的物种，基因覆盖更完整

还包括了CAZY，GMM，GBM等模块

具体差异的意义要结合你的实际研究目标解释

组间各物种分类水平及功能差异

  MetagenomeSeq分析

  更保守，结果可靠性更高

组间物种及功能差异热图

基于上面MetagenomeSeq的结果中，找到差异的物种种属和代谢通路做的热图。

差异菌属与代谢通路之间有什么关系？

差异菌属和功能代谢关联分析

从菌属上的差异，代谢通路的差异等来看，到底是如何关联，是什么类的菌或代谢通路作出贡献。

不同分组之间相对明确区别的模型？

随机森林预测

判断是哪个层面上的数据能最大程度作为分组样本的区分，以及区分效果。

附录里都藏了Big彩蛋：软件操作，问题解答应有尽有

——STAMP，Qiime2等

我们提供的基础分析包括以下所有内容：