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肝脏疾病肠道微生物易位的测定

已有 3198 次阅读 2021-1-27 00:49 |个人分类:医学技术|系统分类:科研笔记

肝脏疾病肠道微生物易位的测定

肠外间隙易位微生物病原体相关分子模式和细菌的测定

人类肠道中有多种微生物群落,它们与宿主共生,促进新陈代谢和消化。体内平衡失调会导致疾病。肝脏疾病通常与肠道通透性增加有关。人和肠道微生物群(细菌和其他微生物)有共生关系。微生物群有助于消化、合成维生素和抵抗病原体的肠道定植,但也含有潜在的致病细菌。肠道内稳态的破坏和肠道微生物组的改变导致许多疾病的发病机制,包括肝病。肠源性病原体相关分子模式的易位与包括酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝炎在内的几种慢性肝病的发病机制有关。

Schnabl和Brenner在他们的文章回顾了破坏肠道内稳态并导致非酒精性脂肪肝、脂肪性肝炎、酒精性肝病和肝硬化的因素,以及肝脏损伤和肠道内稳态紊乱如何共同导致肝脏疾病。文章指出肝脏疾病长期以来一直与肠道微生物群的定性和定量(过度生长)益生菌变化有关。外来因素,如西方饮食和酒精,促成了这些变化。在动物模型中,肠道菌群失衡导致肠道炎症、肠道屏障的破坏和微生物产物的移位。然而,肠道微生物组对肝脏疾病的贡献不仅仅是细菌产物的简单易位,细菌产物会促进肝脏损伤和炎症。在肠道环境中产生的微生物代谢物和宿主因素在肝脏疾病的发病机制中同样重要。

直接评估肠外组织(如门静脉和全身血液循环、肠系膜淋巴结、肝脏和脾脏)中肠源性和易位病原体相关分子模式的水平非常重要。采集样品需要以无菌的方式。所有用于采集样品的仪器都必须是无菌的,不含DNA和RNA。各种ELISA分析和其他试剂盒可用于确定特定病原体相关分子模式的血清或组织水平。脂多糖可以通过传统的鲎试验进行测量,但是现在也可以使用具有更高灵敏度的竞争性ELISA方法检查。

Hartmann等人研究Toll样受体2介导的肠道损伤和肠道肿瘤坏死因子受体I参与小鼠肝纤维化。胆管结扎后,TLR2基因缺陷小鼠的肝纤维化和肠道细菌及细菌产物移位较野生型小鼠少。造血细胞不表达TLR2的小鼠也减少了细菌易位,表明造血细胞表达TLR2调节肠屏障功能。胆管结扎后,野生型小鼠肠固有层中产生肿瘤坏死因子α的TLR2(+)单核细胞数量增加;TNF受体I介导的肠上皮细胞信号促进了细菌移位。他们的研究表明,肠道炎症和细菌易位通过固有层单核细胞的TLR2信号和肠上皮细胞的TNF受体I信号导致小鼠肝纤维化。因此,可以认为肠内TNF受体I是胆汁淤积性肝纤维化的重要介质。

肠屏障功能障碍是酒精性肝病的重要因素。易位的微生物产物引发肝脏的炎症反应,并导致脂肪性肝炎。无菌组织提取物中的微生物蛋白可以用Western Blotting进行检测。Chen等人使用大肠杆菌抗体(Dako)来确定病原体相关分子模式的直接肝易位的方法,研究失调性肠道炎症激活肿瘤坏死因子受体I介导小鼠酒精性肝病。酒精喂养8周可引起空肠炎症,其特征是产生肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的单核细胞和巨噬细胞数量增加。这些发现在慢性酒精滥用患者的十二指肠活检中得到证实。用不可吸收的抗生素清除肠道污染,恢复了小鼠的健康,减少了肠道炎症和通透性,降低了酒精性肝病。TNF受体I(TNF受体I)突变小鼠对肠屏障功能障碍和酒精性肝病有保护作用。TNF受体I对肠上皮细胞的再激活导致肠通透性增加和肝脏疾病,这与酒精喂养后的野生型小鼠相似,表明肠内TNF受体I促进肠屏障功能障碍。肌球蛋白轻链激酶是TNF-α的下游靶点,经酒精处理后在肠上皮细胞中被磷酸化。利用肌球蛋白轻链激酶缺陷小鼠,他们进一步证明了肌球蛋白轻链激酶对慢性酒精喂养后肠道屏障功能障碍和肝脏疾病的部分作用。他们的研究表明,肠道菌群失衡引起的肠道炎症和肠上皮细胞TNF受体I信号介导了肠道屏障的破坏。因此,肠TNF受体I是酒精性肝病的重要介质。

 

Cuenca等人使用普通16S核糖体引物或深度16rRNA测序从组织中扩增细菌DNA研究四氯化碳肝硬化大鼠肠系膜淋巴结微生物组分。他们提出肠道微生物群和免疫系统之间的相互作用是维持体内平衡的关键,发生在肠系膜淋巴结等肠淋巴组织。他们采用实时定量PCR和16S rRNA基因测序方法,比较四氯化碳诱导的肝硬化腹水大鼠和对照组肠系膜淋巴结菌群。用ELISA法测定血样中细胞因子的含量,研究了对照组和肝硬化大鼠肠系膜淋巴结中细菌DNA的存在及其与炎症反应的关系。序列分析显示在对照组和肝硬化大鼠的肠系膜淋巴结中微生物多样性很高,其中蛋白质细菌是最主要的门之一。四氯化碳诱导的肝损伤与细菌负荷的改变无关,但与肠系膜淋巴结中微生物多样性的降低和微生物群落的改变有关。动物双歧杆菌的高比例也与白细胞介素-10表达升高呈正相关。他们的研究在对照组和四氯化碳诱导的肝硬化大鼠肠系膜淋巴结中观察到的高微生物多样性首次证明了细菌易位不仅仅是一种二分法现象。

尽管活菌从肠腔到肠外空间的易位对于肝脏疾病进展的重要性还不完全清楚,但易位活菌在肝脏疾病和肝硬化的晚期中起着重要作用。肠道菌群失衡失调和细菌移位在晚期肝病患者中很常见,有强有力的证据表明细菌及其产物通过上皮屏障的移位推动了实验性肝病的进展。Coffin和Sharpe报道酒精性肝炎患者中有相当一部分死于细菌感染,感染导致的死亡率为12%至54%,强调了肠道漏出以及随后细菌向肠外转移的重要性。

为了检测血液和组织中的活菌,Fouts等人采用标准的需氧和厌氧培养技术研究肝病早期肠道菌群变化及细菌移位的动态变化。他们采用结扎小鼠胆总管致胆汁淤积性肝损伤,注射四氯化碳致小鼠中毒性肝损伤。两种疾病模型均在肝损伤后第1天出现肠通透性增加和细菌移位。同时伴有小肠紧密连接蛋白occludin的表达减少。虽然结扎小鼠胆总管导致肠道细菌快速过度生长,但注射四氯化碳的小鼠仅在肝纤维化晚期观察到细菌过度生长。16S rRNA基因的大规模平行焦测序显示结扎小鼠胆总管后的微生物变化较小,而四氯化碳给药导致与油注入小鼠相比,厚壁菌和放线杆菌相对丰富。四种不同的肝病模型(胆汁淤积、中毒、酒精、肥胖)在肠道微生物组学上几乎没有相似之处。由此表明,急性肝损伤与早期肠道通透性增加和细菌易位有关,而细菌易位先于微生物组的改变。肠道微生物组因肝病的病因而异。

肝脏疾病,尤其是肝脏疾病的晚期,会导致免疫系统受损。患病的肝脏不能像健康器官那样有效地清除细菌和细菌病原体相关分子模式。因此,易位细菌和细菌产物水平的增加可能不一定仅仅是肠道通透性增加的结果,而是肠道屏障和免疫系统功能障碍的综合结果。因此,检测血液和组织中细菌和病原体相关分子模式的方法被认为是肠漏的间接证据。然而,它们对于估计肝病进展和细菌感染的风险很重要。Balmer等人提出肝脏可能是介导宿主与其肠道共生菌群之间相互共生的防火墙,在宿主和栖息在大肠中的微生物群落之间建立共生关系的一个先决条件是微生物的严格的粘膜区隔化。携带微生物的树突状细胞通过淋巴管被阻断在肠系膜淋巴结,构成了肠道淋巴循环的防火墙。他们在不同的小鼠模型中发现,接受肠道静脉血液循环的肝脏形成一道血管防火墙,在肠道病理过程中捕获进入血液的肠道共生细菌。小鼠肝脏中的吞噬性Kupffer细胞通过肝脏自身的动脉供应,独立于脾脏清除系统脉管系统中的共生体。尽管先天免疫增强,但小鼠肝脏防火墙的损伤会损害血液中共生体的功能清除,从而通过增加肠道共生体的全身暴露导致非粘膜免疫反应的自发启动。肝脏疾病(非酒精性脂肪性肝炎)患者的全身免疫反应与肠外共生暴露增加一致。肝脏可以作为一个功能性的血管防火墙,清除已穿透肠道或全身血管回路的共生体。




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A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.娴f粈璐熺€佃鐦弬鍥︽閻ㄥ嫨鈧倷绡冪亸杈ㄦЦ鐠囪揪绱濇稉鎾冲焺鐏炩偓閸︺劌顓搁弻銉ュ灲閺傤厼绱堕柨瀣躬2012楠烇拷8閺堝牅浜掗崥搴f畱閸欐垶妲戞潻鍥┾柤閿涘牆鐤勭拹銊ょ瑐閺勵垱瀵�12閺堬拷12閺冦儳娈戞稉瀛樻娑撴挸鍩勯悽瀹狀嚞閿涘妲告稉宥嗘Ц閸︹娍CIENCE 2012楠烇拷8閺堝牅鍞ら弬鍥╃彿閻ㄥ嫬鐔€绾偓娑撳﹥妯夐懓灞炬鐟欎降鈧拷
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IP: 1.195.108.*   閸ョ偛顦� | 鐠э拷 鐠э拷 +1 [25]safe110   2017-2-18 14:09
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IP: 61.237.136.*   閸ョ偛顦� | 鐠э拷 鐠э拷 +1 [24]瀹€鎶芥祫   2017-2-18 13:45
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IP: 24.7.123.*   閸ョ偛顦� | 鐠э拷 鐠э拷 +1 [23]瀹€鍏呯閺咃拷   2017-2-18 13:25
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IP: 24.7.123.*   閸ョ偛顦� | 鐠э拷 鐠э拷 +1 [22]瀹€鍏呯閺咃拷   2017-2-18 13:23
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IP: 1.195.108.*   閸ョ偛顦� | 鐠э拷 鐠э拷 +1 [20]safe110   2017-2-18 13:05
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[13]safe110 2017-2-18 12:46
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[14]safe110 2017-2-18 12:49
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[15]safe110 2017-2-18 12:56
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2017-2-18 13:081 濡ょ》绱欓崶鐐差槻濡ら棿瀵岄敍锟� 鐠э拷 鐠э拷 +1 | 閸ョ偛顦�
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IP: 24.7.123.*   閸ョ偛顦� | 鐠э拷 鐠э拷 +1 [17]瀹€鍏呯閺咃拷   2017-2-18 11:38
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2017-2-18 12:051 濡ょ》绱欓崶鐐差槻濡ら棿瀵岄敍锟� 鐠э拷 鐠э拷 +1 | 閸ョ偛顦�
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IP: 222.72.107.*   | [16]閻€劍鍩涢崥锟�   2017-2-18 11:03
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2017-2-18 12:141 濡ょ》绱欓崶鐐差槻濡ら棿瀵岄敍锟� 鐠э拷 鐠э拷 +1 | 閸ョ偛顦�
IP: 70.138.58.*   閸ョ偛顦� | 鐠э拷 鐠э拷 +1 [15]鐠嬵厽鏌婇弶锟�   2017-2-17 22:40
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2017-2-18 12:111 濡ょ》绱欓崶鐐差槻濡ら棿瀵岄敍锟� 鐠э拷 鐠э拷 +1 | 閸ョ偛顦�
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IP: 1.195.108.*   閸ョ偛顦� | 鐠э拷 鐠э拷 +1 [11]safe110   2017-2-17 19:46
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IP: 1.195.108.*   閸ョ偛顦� | 鐠э拷 鐠э拷 +1 [10]safe110   2017-2-17 19:42
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2017-2-17 19:461 濡ょ》绱欓崶鐐差槻濡ら棿瀵岄敍锟� 鐠э拷 鐠э拷 +1 | 閸ョ偛顦�
IP: 1.195.108.*   閸ョ偛顦� | 鐠э拷 鐠э拷 +1 [9]safe110   2017-2-17 19:33
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2017-2-17 19:382 濡ょ》绱欓崶鐐差槻濡ら棿瀵岄敍锟� 鐠э拷 鐠э拷 +1 | 閸ョ偛顦�
IP: 110.96.147.*   閸ョ偛顦� | 鐠э拷 鐠э拷 +1 [8]閸掓ê顒熷锟�   2017-2-17 19:30
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IP: 117.136.79.*   閸ョ偛顦� | 鐠э拷 鐠э拷 +1 [7]everyon   2017-2-17 19:21
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IP: 120.236.170.*   閸ョ偛顦� | 鐠э拷 鐠э拷 +1 [6]everyon   2017-2-17 18:58
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IP: 120.236.170.*   閸ョ偛顦� | 鐠э拷 鐠э拷 +1 [5]everyon   2017-2-17 18:54
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2017-2-17 19:241 濡ょ》绱欓崶鐐差槻濡ら棿瀵岄敍锟� 鐠э拷 鐠э拷 +1 | 閸ョ偛顦�
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2017-2-17 19:221 濡ょ》绱欓崶鐐差槻濡ら棿瀵岄敍锟� 鐠э拷 鐠э拷 +1 | 閸ョ偛顦�
閸ョ偛顦�  閿涳拷 Based on our determination that the preponderance of the evidence shows 16 there is no interference-in-fact between the parties閳ワ拷 claims, we need not decide the 17 other pending motions.

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2017-2-17 19:262 濡ょ》绱欓崶鐐差槻濡ら棿瀵岄敍锟� 鐠э拷 鐠э拷 +1 | 閸ョ偛顦�
閸ョ偛顦�  閿涳拷 The  information in unpublished provisional applications was not available to those of  ordinary skill in the art and, therefore, is not relevant to the question of whether  one party閳ユ獨 claims would have been rendered obvious by the other閳ユ獨.

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2017-2-17 20:143 濡ょ》绱欓崶鐐差槻濡ら棿瀵岄敍锟� 鐠э拷 鐠э拷 +1 | 閸ョ偛顦�
IP: 120.236.170.*   閸ョ偛顦� | 鐠э拷 鐠э拷 +1 [3]everyon   2017-2-17 18:30
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IP: 120.236.170.*   閸ョ偛顦� | 鐠э拷 鐠э拷 +1 [2]everyon   2017-2-17 18:24
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閸ョ偛顦�  閿涳拷 濞屸剝婀佸⿻蹇ョ礉闁絼閲滃В宥夋诞瀹歌尙绮¢弰鐤峅UDna閻ㄥ嫪绨¢敍灞惧娴犮儰绗夋导姘毉閻滈绮堟稊鍫濇勾閺傝婀佹ウ锛勬畱闂傤噣顣介妴鍌炴诞鐏忛亶鍋呮稊鍫滅閸欘亷绱欏В宥夋诞閿涘奔绗夐崠鍛閸忣剟娴敍澶堚偓锟�
2017-2-17 19:211 濡ょ》绱欓崶鐐差槻濡ら棿瀵岄敍锟� 鐠э拷 鐠э拷 +1 | 閸ョ偛顦�
IP: 202.113.11.*   閸ョ偛顦� | 鐠э拷 鐠э拷 +1 [1]閺夈劍顒滈悺锟�   2017-2-17 18:17
  
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