狂犬病毒的分子流行病学（3）

——大型学术专著《狂犬病（Rabies）》最新版选译

第5章 分子流行病学（Molecular epidemiology）

作者：Susan A. Nadin-Davis

加拿大渥太华：加拿大食品检验署，渥太华Fallowfield实验室。

（Canadian Food Inspection Agency, Ottawa Laboratory- Fallowfield, Ottawa, ON, Canada）

5.3　病毒分型方法（Methods of viral typing）

5.3.2 高通量测序(HTS)方法的应用

（Application of high-throughput sequencing (HTS) methods）

使用上述传统方法，整个丽沙病毒基因组的序列都可以确定，但这个过程是非常耗时的，因为需要扩增许多重叠的扩增子（amplicons）序列，然后使用传统的Sanger测序方法，通常每个反应可产生大约600－900个碱基的单一序列的读数。21世纪的第一个十年，商用HTS（high-throughput sequencing，高通量测序）平台的发展，是由罗氏( Roche）公司的454测序系统开始，随后是Illumina （因美纳）和离子激流技术（Ion Torrent technologies）的跟进，结果在用于研究病毒分子流行病学的方法上引发了另一场革命。这些HTS平台能从汇集的索引样本中产生数千个较短序列的读数，然后通过物理和生物信息学手段，根据样本来源对这些序列数据进行整合。这些平台产生的大量数据给出了成千上万的部分重叠的读数，这些读数可以通过比对和组装来获得完整的病毒基因组的序列，而与传统的方法相比则可以节约专业人员的大量精力和时间。即使是较新的平台，比如牛津纳米孔（Nanopore）微型测序仪，也可以读取更长的序列，有望进一步带来病毒基因组学的革命。

然而，根据具体的研究目标，将这些新技术应用于丽沙病毒流行病学可能涉及不同的测序策略。这些方法主要可区别为两种，一种是将从感染的脑组织中获取的RNA用鸟枪法（shotgun approach）进行测序,这可能会也可能不会涉及去除宿主的某些核酸但避免病毒核酸放大，另一种是将经RT-PCR产生的病毒的重迭的扩增子用于测序。这两种方法各有利弊。鸟枪法避免了RT-PCR可能带来的任何偏差，而RT-PCR的成功扩增依赖于使用与目标序列相匹配的引物。当试图对可能与该属已知成员显示出显著序列差别的新丽沙病毒进行测序时，这一点变得尤为重要。根据样本感染水平的不同，如果在测序过程中合并了太多的样本，这种方法可能导致沿病毒基因组长度的覆盖水平有限;然而限制样本池的方法可能显著增加成本。涉及病毒基因组扩增的方法确保了在基因组长度上的高覆盖率，即使是在将大量样本汇集在一起进行测序操作时，也能使每个样本的成本最小化。后一种方法已成功应用于相对局部或地区水平上的单个病毒变种的分子流行病学研究，但如果需要扩增多个变种，引物设计可能会变得更加复杂。　　

全球范围内HTS技术在丽沙病毒研究中的应用反映在提交到公共序列数据库的整个病毒基因组数量的增加。无论采用何种方法进行测序，主要目标通常是编译一个分离物的一致序列，即代表基因组每个位置上最常见的核苷酸碱基的序列。然而，在某些情况下，分离物内的病毒多样性程度是显著的，传统方法是通过将扩增子插入质粒载体，然后对多个克隆进行测序来获得序列数据。随着高度并行测序方法的发展，直接解析样本的遗传多样性现在是可能的，体现这一能力的几个应用将在稍后介绍。

参考文献：

唐青 严家新：第六章 狂犬病病毒的分子流行病学和系统进化史，《狂犬病和狂犬病疫苗》(俞永新主编，中国医药科技出版社，2009年版)

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