简介：

每种化学物质都可以吸收、透射或反射一定波长的光。其浓度可以反应为光谱改变的强度。而分光光度计就是用于测量光透过样品后被吸收特定波长光的光子量。

原理：

根据光源的波长长度，可以将分光光度计分类为紫外-可见光分光光度计和红外分光光度计。
紫外-可见光分光光度计：紫外光波段（185~400 nm），可见光波段（400-700 nm）
红外分光光度计：红外光波段（700~1,5000 nm）

分光光度计机器结构

Fig1：分光光度计基本结构（by Heesung Shim）

详细原理：

光源产生光，瞄准仪（滤镜）将光聚集透过单色仪（棱镜），分成几个分量的波长（光谱），然后通过波长选择器（狭缝），传输所需要的波长。特定波长I0的光透过样品后，会被吸收一部分，变成It。光度计则检测It光子量，通过计算，将信号发送到数字显示器。
不同的化合物有不同的最佳吸光度。例如对硝基酚（酸形式）在320 nm处有最佳吸光值，硝基苯酚盐（碱形式）在400 nm处有最佳吸光值。

计算公式

光透过比色皿和样品时，有一部分光被吸收，而光的吸收量与样品浓度呈线性关系。通过对I0和It的测量，并用比尔-兰伯特定律(Beer-Lambert law)进行计算，可计算出样品的浓度。

光吸收值：

比尔-兰伯特定律：

• A:测量的光吸收值。又称光密度“OD”值。
• ε：摩尔吸光系数。
• l:光在样品中走过的路径长度。
• c: 样品浓度。

各个参数及其含义：

• 核酸中的嘌呤和嘧啶碱具有共轭双键，在240~290 nm紫外处具有强烈的吸收值。在260 nm处具有吸收峰值，230 nm处具有吸收低谷。
• 蛋白质因其有芳香氨基酸，在280 nm处具有吸收峰值。
• 盐和小分子的吸收峰值集中在230 nm处。
  纯度分析：

高纯度：

• DNA：A260/A280 1.8~1.9; A260/A230 >2.0
• RNA：A260/A280 1.9~2.0; A260/A230 >2.0
• RNA的A260/280比值要比DNA的值高一些，这是因为碱基U的A260/280的比值要比碱基T的A260/280比值更高。

异常：

• A260/A280>1.9：RNA可能未除尽
• A260/A280<1.8: 含有酚或蛋白质
• A260/A230<2.0: 有残存盐或小分子污染

注意事项：

1. 紫外分光光度法不能很好区分DNA和RNA之间的相互污染，需用电泳进行鉴定。
2. 若A260/A280=1.8，也可能是蛋白质和RNA同时污染，可通过电泳鉴定RNA，或对图形分析，看A280 nm吸收光值高低来判断蛋白质污染。
3. A260/A280的值会受到样品PH和离子浓度的影响。为了确保准确测量，请使用与悬浮或洗脱样品时相同的缓冲液。
4. 样品浓度过低或过高都可能影响准确性。
5. 注意操作时，样品要混合均匀，不要有气泡。

参考文献:

1. “Spectrophotometry”. LibreTexts
2. “Nanodrop经验谈”. 于浩然. 科学网博客
3. “260/280 260/230”. 汤强. 科学网博客
4. “OD值和吸光度值”. Zmj0630. 丁香园