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取 500 μL 抗凝血加入 1.5 mL EP 管中。抗凝剂推荐使用 EDTA-Na2 或枸橼酸钠。如果是肝素抗凝,则血液样本不可以长期保存。
洗血:加入生理盐水(或 PBS) 1 mL,混匀,4000 r/min,10 min。弃上层液。重复一次。
溶血:加入相当于压积体积 5.5 倍的溶血试剂(1 mL)。混匀后在 4℃中静置 15 min,血液由浑浊红色变为透明红棕色。
溶血试剂:0.144M 的 NH4Cl 和 0.01M 的 NH4HCO3 按 10:1 混合使用。
4000 r/min 离心 10min,弃去上层液。
注:溶血的目的是裂解红细胞,离心后将其去除。因为红细胞没有细胞核,不能提供 DNA。
消化:在压积细胞中加入 200 μL 白细胞悬浮液。用枪头吹吸混匀,然后再加 200 μL 白细胞悬浮液,混匀;然后加入 5 μL 浓度为 20 mg/ml 的 proteinase K,混匀;最后加入终浓度为 0.5%的SDS,混匀。置 37℃消化过夜或 56℃消化 3 hrs。
白细胞悬浮液 :
成分 | 体积 |
---|---|
1M TrisTris -HCl (pH7.5) | 20 mL |
0.5 M EDTA | 0.2 mL |
5M NaCl | 2 mL |
注:加入 SDS 时,要让枪头一边从下到上旋转运动,一边加入 SDS,避免 SDS 集中在液体的某处,消化的目的是破白细胞。
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