代谢学人

Cell Metabolism：棕色脂肪的“朋友圈”

初稿撰写 | 陈明洁

初稿修改 | 皮婉莹 郭钰涵 周文豪

排版 | 陈明洁

背景介绍

循环microRNA（miRNA）可通过高度有序的机制分泌至血浆中，主要以小细胞外囊泡（sEVs）/外泌体包裹或与血浆蛋白（如Argonaute蛋白、载脂蛋白）结合的形式存在。既往研究表明，脂肪组织，尤其是棕色脂肪组织（BAT），是循环miRNA的重要来源。活性BAT有利于维持机体代谢健康，并与啮齿类动物和人群的心脏益处相关。BAT具有线粒体密度高、解偶联蛋白1（UCP1）高表达等特征，可通过产热促进能量消耗。BAT的代谢作用一部分来源于其促进能量消耗的能力，另一方面也可通过分泌多种生物活性分子，对远端器官产生有利的代谢效应。这些由BAT分泌的活性因子被统称为“BATokines”，包括代谢物、蛋白质、脂质和miRNA。

近期研究表明，BAT分泌的部分miRNA可被其他组织摄取，并调控受体组织中的基因表达和代谢过程。例如，BAT分泌的miR-99b-5p和miR-378均可被肝脏摄取，分别抑制肝脏Fgf21表达和调节糖异生。已有研究发现，miRNA通过sEV分泌是一个受到严格调控的过程，部分依赖于miRNA自身的核苷酸基序，因此被分泌的miRNA仅代表分泌细胞内miRNA的一部分。此外，脂肪组织及其他组织中miRNA的分泌还可受到胰岛素及其他刺激因素的调控。脂肪组织来源循环miRNA的重要性还体现在其与衰老及代谢状态之间的密切联系。Dicer是miRNA生物合成过程中的关键酶，其在衰老小鼠脂肪组织中表达下降，而热量限制可恢复其表达，这一变化趋势与多种循环miRNA的变化一致。在脂肪细胞中特异性敲除Dicer，或在小鼠及脂肪营养不良患者中出现脂肪组织缺失时，多种循环miRNA水平均显著下降；移植野生型小鼠的脂肪组织，尤其是棕色脂肪组织，可部分恢复这些循环miRNA水平，同时伴随着代谢状态和胰岛素抵抗的明显改变。综上，这些研究支持脂肪组织中存在一套高度有序且受代谢状态调控的miRNA分选和分泌机制，使脂肪组织来源的循环miRNA能够作为组织间的代谢调节因子发挥作用。然而，目前仍无法在体内通过高通量手段系统性地证明miRNA在不同组织之间的转运。近期，一篇发表于《Nature Metabo

lism》上的研究利用BAT特异性表达微生物来源尿嘧啶磷酸核糖转移酶（UPRT）的小鼠，并通过4-硫尿嘧啶（4TU）对BAT中的miRNA进行体内标记，发现不同miRNA可通过sEV或与血浆蛋白结合的形式，以不同程度从BAT分泌。更值得注意的是，这些分泌型miRNA在肝脏、肌肉和下丘脑中的摄取存在差异，并且在许多情况下，对这些组织中相应miRNA的丰度具有显著贡献。最后，研究发现BAT来源的miRNA能够进入远端组织中的RNA诱导沉默复合物（RISC），并与靶基因直接相互作用，从而调控受体组织的代谢过程，包括BAT来源的miR-1a-3p转运至肌肉后抑制FoxO1。综上，该研究揭示了一个由分泌型miRNA介导并参与内分泌调控的强大细胞通讯网络。

敲黑板啦

1.BAT可通过sEV和非sEV途径选择性分泌miRNA。

2.BAT来源miRNA可选择性转运至肝脏、肌肉和下丘脑。

3.BAT来源miRNA可进入受体组织并调控代谢相关通路。

4.BAT miRNA缺失导致肌肉线粒体及代谢功能异常。

5.BAT来源miR-1a-3p通过靶向FoxO1调控肌肉线粒体生物发生。

研究结果

1、4TU介导的BAT特异性RNA标记体系及smRNA测序分析

尿嘧啶磷酸核糖转移酶（UPRT）可催化尿嘧啶转化为尿苷单磷酸（图1a）。然而，哺乳动物及其他高等真核生物中的UPRT同源蛋白无酶活性，因此，外源表达微生物来源的UPRT可用于4TU介导的细胞特异性RNA标记（小编注：4TU是一种尿嘧啶类似物，在具有酶活性的微生物来源UPRT存在时，可被掺入新合成的RNA中。通过将UPRT限制性表达于特定细胞或组织，即可只对该来源的新生RNA进行4TU标记，形成含有硫代基团的标记RNA，其硫代基团可进一步与生物素化试剂反应，从而将biotin连接到4TU-RNA上。随后，streptavidin（链霉亲和素）可特异性结合biotin，而与其偶联的HRP可催化化学发光反应。产生的光信号由成像系统记录，从而实现对4TU标记RNA的检测。）。基于这一原理，为了标记并追踪BAT中特异性产生的miRNA，研究人员将携带由lox-STOP-lox盒控制、带有HA标签且具有酶活性的UPRT基因（弓形虫来源）的雄性小鼠，与UCP1启动子驱动Cre重组酶的小鼠进行杂交，从而实现UPRT在BAT中的特异性表达（小编注：lox-STOP-lox系统是一种常用的条件性基因表达策略，其中STOP序列会阻断下游基因的表达；当Cre重组酶存在时，Cre可识别两侧的lox位点并切除STOP序列，从而启动下游基因表达。由于这里的Cre由UCP1启动子驱动，因此主要在UCP1阳性的棕色脂肪细胞中发挥作用，使UPRT在BAT中实现特异性表达。），并通过HA免疫印迹（图1b）和qPCR（扩展数据图1b）实验进行验证（小编注：HA是一种常用的短肽标签，可与目标蛋白融合表达，便于后续检测。HA免疫印迹即利用针对HA标签的抗体进行Western blot，从而判断带有HA标签的UPRT是否在目标组织中表达。）。随后，通过腹腔注射4TU进行RNA标记（剂量为50 mg kg⁻¹，每48h注射一次，持续7d）。然后提取RNA，并对其中的4TU基团进行生物素化，以便后续通过streptavidin–HRP进行检测（图1c,d）。与UPRT的表达模式一致，仅在UCP1; UPRT小鼠的BAT中检测到4TU掺入RNA，而在同窝UPRTfl/fl对照小鼠（小编注：fl/fl表示UPRT相关构建处于“floxed”状态，即小鼠不含UCP1-Cre，STOP序列未被切除，因此作为不表达外源UPRT的对照组。）的BAT或皮下白色脂肪组织（sWAT）中均未检测到（图1c和扩展数据图1c）。进一步将生物素化或未生物素化的RNA经尿素-PAGE分离（小编注：尿素-PAGE是一种用于分离RNA的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。尿素可破坏RNA的二级结构，使RNA主要根据分子大小进行迁移，从而便于后续转膜并检测不同长度范围的RNA。），并使用streptavidin–HRP进行检测，结果显示，仅在UCP1; UPRT小鼠BAT来源的生物素化RNA中观察到明显的4TU-RNA标记信号，而经4TU处理的UPRTfl/fl小鼠BAT中未检测到相应标记（图1d）。

为了纯化4TU标记的RNA用于后续分析，研究人员利用streptavidin–Dynabeads沉淀并富集biotin–4TU RNA复合物（小编注：Dynabeads是一种表面偶联了链霉亲和素（streptavidin）的磁性微珠。由于链霉亲和素与生物素（biotin）之间具有极高的亲和力和特异性结合能力，当样品中的生物素化RNA（如经4TU标记并生物素化的RNA）与这类磁珠孵育时，链霉亲和素会特异性“捕获”生物素化分子，使其结合到磁珠表面。随后通过外加磁场将磁珠（连同结合在其上的目标RNA）从溶液中吸附分离出来，未被生物素标记的RNA及其他杂质则被洗脱去除，从而实现对生物素化RNA的特异性富集/沉淀。）。随后，使用人工合成的含单个4TU基团的RNA寡核苷酸验证pull-down效率，结果证实只有含4TU并经生物素化的寡核苷酸能够被成功富集（扩展数据图1d）。研究人员在UCP1; UPRT小鼠的BAT中检测到4TU标记的RNA转录本，而在肝脏中未检测到，从而进一步验证了BAT特异性标记。其中，Malat1（核lncRNA）、Rab11b和Chmp2b（参与细胞外囊泡生成）均在BAT中被4TU标记（小编注：lncRNA（long non-coding RNA）是指长度大于200个核苷酸的RNA分子。），并受到β3-肾上腺素能受体激动剂（CL 316243）刺激的调控，但在肝脏中未检测到相应标记（扩展数据图1e）。值得注意的是，此前已被证实可由BAT转运至肝脏的miR-99b-5p在BAT中被4TU标记，并在β3激动剂刺激后增加约4倍，同时这些小鼠肝脏中被标记的miR-99b-5p也同步升高（扩展数据图1f）。类似地，刺激BAT后，肌肉中多种miRNA水平升高，其中包括肌肉中丰度最高的miRNA——miR-1a-3p（扩展数据图1h）。值得注意的是，肌肉中的miR-1初级转录本（pri-miR-1）反而降低（扩展数据图1i），而肝脏和肌肉中未发现β3-肾上腺素能受体，提示这些miRNA可能由BAT转运而来。综上表明，4TU可在UCP1;UPRT小鼠中实现BAT特异性RNA标记，并可由BAT转运至肝脏。

为了全面解析BAT中小非编码RNA的组成及其4TU标记情况，研究人员对UCP1;UPRT小鼠BAT中的4TU富集RNA组分和总RNA组分进行了小RNA（smRNA）-seq。在总smRNA中，miRNA占测序reads的54%，其次为tRNA（33%）、rRNA（9%）、核仁小RNA（snoRNA）（2%）和核小RNA（snRNA）（1%）（图1e和扩展数据图2a）。而在4TU富集组分中，tRNA占比最高（52%），其次为miRNA（34%）、rRNA（11%）、snoRNA（2%）、snRNA（1%）和piRNA（1%）（图1f和扩展数据图2a）。由于已有研究表明，分泌型miRNA能够介导细胞间通讯，因此研究人员将miRNA作为后续分析重点。在测序鉴定到的658种miRNA中，研究人员进一步关注了BAT中4TU标记程度最高的前20%，共131种miRNA（图1g）。对于这131种miRNA，其4TU标记miRNA丰度与BAT中总miRNA丰度之间呈高度相关（R² = 0.90）（图1h），表明4TU标记已接近稳态。尽管随着miRNA中尿嘧啶含量增加，其标记程度表现出轻微升高趋势，但miRNA的尿嘧啶含量与标记效率之间并不存在相关性（扩展数据图2b），提示影响标记效率的主要因素可能是RNA的周转速率。值得注意的是，由于miR-1a-3p、miR-206-3p和miR-133a-3p在肌肉中丰度较高，因此也常被称为“myomiRs”，而这些miRNA在BAT中均属于4TU标记程度较高的miRNA（图1h）。此外，标记程度较高的miRNA还包括在脂肪生成中具有明确功能且在脂肪组织中丰度较高的let-7家族，以及已知具有代谢调控功能的miR-99b-5p、miR-378a-3p和miR-143-3p。

图1. 4TU/UPRT模型介导的BAT特异性RNA标记

扩展数据图1. 4TU-RNA标记原理及特定转录本标记水平分析（与图1相关）

扩展数据图2. UCP1;UPRT小鼠BAT中4TU标记smRNA的测序分析（与图1相关）

2、BAT分泌的4TU miRNA存在于血浆sEV和非sEV相关组分中

miRNA可与多种载体结合，这些载体不仅能够保护miRNA免受RNase降解，还可促进其向远端器官转运。常见载体包括细胞外囊泡（sEVs），以及RNA结合蛋白（RBPs）、Argonaute蛋白（Ago2）和脂质颗粒（VLDL/LDL和HDL）等非sEV载体。为了进一步了解BAT来源miRNA如何释放进入循环，研究人员收集UCP1;UPRT小鼠的血浆，并通过体积排阻色谱（SEC）将其分离为sEV富集组分和非sEV组分（图2a）（小编注：体积排阻色谱（SEC），又称凝胶过滤色谱，是一种依据分子体积大小分离蛋白质等生物大分子的色谱技术。色谱柱内填充有多孔凝胶介质，大分子因无法进入填料孔道，只能沿颗粒间隙流动，因此洗脱较早；小分子则可自由进出孔道，经过的路径更长，因此洗脱较晚。一般来说，体积较大的组分会更早流出色谱柱，因此可用于将sEV与较小的蛋白质等成分分开。）。纳米颗粒追踪分析显示，sEV主要富集于第2–7组分（图2a和扩展数据图3a）（小编注：纳米颗粒追踪分析（NTA）是一种用于检测液体样品中纳米级颗粒粒径和浓度的技术。其原理是利用激光照射样品中的颗粒，并通过摄像系统记录颗粒的布朗运动，再根据颗粒运动速度估算其粒径并计算颗粒浓度。通过比较不同SEC组分中的颗粒数量，可以判断纳米颗粒主要富集在哪些组分中；但NTA本身不能直接证明这些颗粒就是sEV，因此还需要结合Alix、Cav-1和CD9等sEV标志蛋白的检测结果进行确认。）；免疫印迹进一步检测到这些组分中富含Alix、Cav-1和CD9等sEV标志蛋白（图2b）。相比之下，第11–18组分（以下简称非sEV组分）中纳米颗粒相对较少，且未检测到sEV标志蛋白，但富含多种蛋白，包括Ago2、ApoB100（VLDL/LDL组分）以及Apo-AI（HDL组分）（图2a,b和扩展数据图3a）。

随后，研究人员通过qPCR检测分离后血浆中的3种代表性miRNA。结果显示，miR-21a-5p几乎仅存在于sEV组分中，let-7c-5p主要存在于非sEV组分中，miR-199a-3p则在两类组分中均可检测到（图2c）。这一现象并不局限于小鼠。在分化的人棕色脂肪细胞（hBAT）来源sEV中同样检测到较高水平的miRNA（扩展数据图3b）。其中，hBAT来源sEV中的miR-1a-3p水平约为分化的人白色脂肪细胞（hWAT）来源sEV的5倍（扩展数据图3b）。单独使用RNase A处理并不会影响sEV和非sEV组分中的miR-1a-3p水平；而经Triton X-100预处理后再加入RNase A，可使sEV中的miR-1a-3p降低86.5%，但对非sEV组分中的miR-1a-3p没有明显影响（扩展数据图3c），从而证实miRNA被包裹于sEV内部（小编注：Triton X-100是一种常用的非离子型去污剂，可破坏细胞膜和细胞外囊泡的脂质双层结构，使囊泡内部包裹的分子暴露出来。因此，在RNase A处理前加入Triton X-100，可先破坏sEV膜，使原本受到膜保护的miRNA暴露并被RNase A降解）。综上，通过SEC分离血浆中的sEV和非sEV载体，发现不同miRNA可分别与sEV或非sEV载体结合，部分miRNA则可同时存在于两类载体中。

为了进一步解析BAT中miRNA的分泌情况，研究人员分别合并sEV和非sEV组分，并对其中的4TU富集RNA和总RNA进行smRNA-seq，以鉴定血浆中4TU标记的BAT来源smRNA。在sEV和非sEV组分中，丰度最高的smRNA均为tRNA/tRFs，其次为miRNA；其中，miRNA分别占sEV和非sEV组分测序reads的27%和17%（小编注：测序reads是测序仪读出来的一段段短序列，是后续做比对、定量、差异分析的最小数据单元。在二代测序中，样本先被打断成很多小片段，再进行测序。每一段被读取到的序列，都可以看作一个read。在RNA测序里，reads来源于cDNA片段。RNA先去除rRNA，再打断mRNA，逆转录成cDNA，最后进入测序流程。）。sEV组分中其余reads主要包括snoRNA、snRNA和piRNA，而这些smRNA在非sEV组分中几乎不存在，各自约占1%（扩展数据图3d）。相比之下，在4TU富集组分中，miRNA分别占sEV和非sEV组分4TU标记smRNA reads的48%和35%，表明与其他smRNA相比，BAT是循环miRNA的重要来源（扩展数据图3d）。总体而言，研究人员在血浆中检测到55种丰度较高的4TU标记miRNA，这些miRNA在sEV和非sEV组分中的分布程度各不相同。通过计算相对富集评分（相对富集评分=log₂(sEV/non-sEV)。sEV：小细胞外囊泡组分中某物质的量，如某蛋白、某miRNA、某脂质的丰度；non-sEV：非小细胞外囊泡组分中同一物质的量；sEV/non-sEV：该物质在sEV中相对于non-sEV的富集倍数。评分>0表示该物质在sEV中富集，评分=0表示两组分中含量相当，无富集，评分<0表示该物质在non-sEV中富集（sEV中反而少）），研究人员发现，其中18种4TU miRNA在sEV组分中富集超过1.8倍（图2d）。例如，let-7-f2在sEV中的丰度约为非sEV组分的45倍，而代表性miRNA miR-21a-5p在sEV中的丰度约为非sEV组分的8倍（图2c–e）。相比之下，另有18种4TU miRNA在非sEV组分中富集至少1.7倍（图2d），其中包括代表性miRNA let-7c-5p，以及在非sEV组分中丰度约为sEV组分32倍的miR-339-5p（图2d,e）。其余19种4TU miRNA在两类组分中的丰度大致相当（图2d）。综上，BAT来源的不同miRNA可通过sEV或非sEV途径以不同程度分泌，而这种载体偏好并不取决于其在血浆中的总体丰度。

可以预期的是，血浆中部分丰度较高的4TU miRNA在BAT中同样具有较高的标记水平，其中包括富集于sEV组分的let-7g-5p和let-7f-2，以及富集于非sEV组分的let-7f-5p和let-7c-5p（图3a）。血浆中丰度最高的miRNA——miR-1a-3p［log2(CPM) = 15.2，其中58%的reads位于sEV组分；CPM表示每百万reads计数］，在BAT中同样具有较高丰度［log2(CPM) = 11.7］（图3a）。另一方面，部分4TU miRNA在BAT和血浆中的丰度存在明显差异。miR-122-5p在BAT中的丰度相对较低［log2(CPM) = 4.5］，但却是血浆中丰度第二高的4TU miRNA［log2(CPM) = 14.2，其中52.6%位于sEV组分］（图3a）。总体来看，BAT中miRNA丰度与其在血浆中的丰度仅呈弱相关。例如，带有4TU标记的miR-125a-5p、let-7c-5p和let-7a-5p在BAT中丰度较高，但在血浆中的水平相对较低；相反，miR-375-3p、miR-92b-5p和miR-340-5p在血浆中的丰度则高于BAT（图3a；扩展数据图3e）。其中，miR-5108和miR-3968这两种4TU miRNA在血浆的sEV和非sEV组分中均可被明显检测到，但在BAT中却未检测到，提示这些miRNA虽然在BAT中产生，但几乎全部用于分泌。相反，在BAT中4TU标记程度较高的miRNA中，有80种在血浆的sEV和非sEV组分中均未检测到，提示BAT产生的相当一部分miRNA可能并未被分泌，或通过其他组织/机制被迅速清除（见下文及扩展数据图4a）。

既往研究表明，决定miRNA分选进入sEV的一个重要因素，是miRNA序列中存在特定的核苷酸基序，这些基序可被Fus、hnRNPA1和Syncrip等RNA结合蛋白（RBPs）识别。为了确定这一现象是否同样存在于体内，研究人员利用MEME Suite（小编注：MEME Suite是一套用于生物序列基序分析的工具，可在一组DNA、RNA或蛋白质序列中寻找反复出现并显著富集的短序列特征。此处MEME Suite用于比较不同分泌类型miRNA的序列，从而筛选可能与sEV、非sEV分泌或细胞内保留相关的特征基序。），对分泌至sEV或非sEV组分中的4TU标记miRNA进行了序列分析。结果发现，在富集于sEV或非sEV组分的miRNA中，存在多种显著富集的5–7个核苷酸长度的基序（图3b–d）（小编注：基序，也称模序、模体，是DNA、蛋白质等生物大分子中具有特定序列模式或结构特征的保守单元，它可以是蛋白质中的结构基序（如GxxxG基序、脯氨酸凸起基序）[3] [8]，也可以是DNA（如i-基序）或RNA（如碱基对基序）中的特定结构。）。其中，“UCUKGG”基序在于18种sEV富集miRNA中的7种（P = 7.33×10⁻⁴），而在未富集于sEV的miRNA中未检测到该基序（图3b）。类似地，“UGAGK”基序存在20种于通过两种机制分泌的20种miRNA中的11种（图3c）；而“CCUCCA”基序则存在于19种主要通过非sEV（蛋白结合）组分分泌的miRNA中的9种（P = 4.94×10⁻⁵）（图3d）。在BAT中4TU标记程度较高、但在任何分泌性4TU miRNA组分中均未检测到的80种miRNA中，“URCCU”“BUDCUG”和“CKUUC”基序分别存在于72–86%的血浆未检出miRNA中，而在已分泌miRNA中仅占0–6%（图3e）。进一步将这些序列基序与已知RBP的基序识别偏好进行比对后发现，sEV miRNA中的部分基序与PTBP3、PUF60、FUBP1/3和IGF2BP1的识别基序相匹配，而非sEV miRNA中的部分基序则与SRSF2/4/5/8/10和RBM6/23的识别基序相匹配（扩展数据图4b,c）。相比之下，BAT中存在但未在血浆中检测到的miRNA，其基序与PCBP2/4和RBM22/23/45蛋白的识别基序更为相似（扩展数据图4b）。这些结果表明，不同miRNA可通过sEV或非sEV途径进行分泌，而这一过程可能部分取决于miRNA自身所含的基序。不过，这一假设仍需进一步研究加以验证。

图2. 利用4TU-smRNA-seq分析血浆sEV和非sEV相关组分中的BAT来源smRNAs

图3. BAT miRNA向sEV和非sEV组分的选择性分泌

扩展数据图3. 血浆组分分离及sEV和非sEV相关smRNA分析（与图2和图3相关）

扩展数据图4. 分泌型miRNA以及在肝脏、肌肉和下丘脑中检出但血浆中未检出的BAT来源miRNA与RBP的潜在相互作用（与图3相关）

3、BAT来源4TU miRNA向肝脏、肌肉和下丘脑的转运

为了追踪BAT分泌的4TU miRNA向远端器官的转运，研究人员对UCP1;UPRT小鼠中生物素化的4TU RNA进行了dot blot（斑点印迹）分析。结果显示，BAT中存在大量4TU RNA，同时在肝脏、肌肉、心脏和脑中也检测到较强的4TU标记信号，而胰腺中未检测到信号，脾脏和肾脏中的信号则接近背景水平（扩展数据图5a）。这一结果与4TU标记miRNA可由BAT转运至部分而非所有组织的现象一致。为了进一步追踪BAT来源miRNA向远端组织的转运，研究人员对这些小鼠肝脏、肌肉和下丘脑中的总RNA和4TU富集RNA进行了smRNA-seq。正如预期，不同组织中的smRNA组成存在明显差异，snoRNA在下丘脑中的丰度很高，在BAT和肝脏中也具有较高水平，而在肌肉中的丰度则很低（扩展数据图5b）。相比之下，在4TU富集组分中，snoRNA约占BAT中4TU标记smRNA的12%，但在下丘脑及其他组织中均未检测到4TU标记的snoRNA，表明snoRNA未由BAT转运至其他组织（扩展数据图5b）。而在肝脏、肌肉、下丘脑以及血浆中，丰度最高的4TU标记smRNA均为miRNA，其次为tRNA/tRFs（扩展数据图5b），这一结果与这些小RNA可由BAT转运至上述组织的结果一致。

扩展数据图5. BAT来源miRNA在远端组织中的富集（与图4相关）

4、BAT来源miRNA的组织间转运图谱

为了构建BAT来源4TU标记miRNA的组织间转运图谱，研究人员整合了血浆sEV和非sEV组分中的4TU miRNA数据，以及这些miRNA在肝脏、肌肉和下丘脑中的富集情况。根据其在血浆中的载体类型，将miRNA分为三组：sEV富集、非sEV富集以及同时存在于两类组分中，并将其与相应的富集组织相连接；连线的粗细表示4TU miRNA在受体组织中的相对丰度（图4a）。检测到55种4TU miRNA在BAT中分泌进入血浆，其中17种在肌肉中富集，13种在肝脏中富集，25种在下丘脑中富集（图4a）。值得注意的是，所有类型的循环载体均可观察到组织靶向性，即miRNA在特定组织中的富集。具体来看，在靶向肌肉的miRNA中，3种主要通过sEV分泌，包括let-7f-2、miR-10b-5p和miR-199a-3p；6种主要存在于非sEV组分中，包括let-7f-5p、miR-206-3p和miR-133a-3p；另外8种则同时存在于两类组分中，包括let-7i-5p、miR-486b-5p和miR-1a-3p。值得注意的是，经过1周的标记后，4TU标记的miR-1a-3p、miR-206-3p和miR-133a-3p在靶组织肌肉中和来源组织BAT中的水平相近（图4b和扩展数据图6a），提示这些miRNA由BAT向肌肉发生了较高程度的转运。尤其值得注意的是，miR-1a-3p是肌肉中丰度最高的miRNA，并被称为“myomiR”。类似地，13种BAT来源且带有4TU标记的循环miRNA优先富集于肝脏（图4a,c和扩展数据图6b）。其中接近一半（13种中的6种）通过sEV转运，而仅有3种主要存在于非sEV组分中。富集于肝脏的4TU miRNA包括miR-148a-3p、miR-21a-5p和miR-122-5p，这些miRNA均被认为是肝脏疾病的标志物。其中，miR-122-5p是肝脏中丰度最高的miRNA，可占miRNA测序reads的70%；而肝脏中4TU标记miR-122-5p的水平比BAT高出多个数量级（图4c），提示其由BAT向肝脏的转运程度非常高。与此一致，尽管miR-122在BAT中的丰度仅处于中等水平，但标记的miR-122却是血浆中丰度第二高的4TU miRNA（图3a）。最后，在血浆中检测到的BAT标记miRNA中，接近一半富集于下丘脑。其中，9种主要通过sEV转运，9种主要存在于非sEV组分中，另有7种同时存在于两类组分中（图4a）。富集于下丘脑的miRNA包括let-7家族的多个成员（let-7a-e/g-5p），以及miR-30d-5p和miR-125a/b-5p（图4a,d和扩展数据图6c）。同样，下丘脑中多种4TU标记miRNA的丰度与BAT相当，甚至高于BAT（图4d），提示这些miRNA由BAT向下丘脑发生了较高程度的转运。

为了确定miRNA的3p和5p两条臂是否都能够发生转运，研究人员选取了3种转运程度较高的miRNA——miR-1a、miR-122和miR-125b，并分别比较其两条臂的总miRNA水平和4TU标记水平（图4e–g）。结果显示，在总miRNA组分中，3p和5p两条臂均可被检测到，但只有在BAT中被4TU标记的那一条臂能够转运至受体组织。具体而言，尽管受体组织中可以明显检测到相应的另一条miRNA臂，但在血浆和受体组织中，仅检测到带有4TU标记的miR-1a-3p、miR-122-5p和miR-125b-5p（图4e–g）。这提示受体组织中存在内源性miRNA生成；而4TU富集组分中仅检测到其中一条臂（且通常为优势臂），进一步支持BAT特异性标记后，miRNA经历链选择并被分选用于分泌的结论。最后，值得注意的是，另有80种4TU miRNA可在BAT中检测到，且在血浆的sEV和非sEV组分中均未达到可检测水平，但出现在其他组织中。其中，14种主要富集于肝脏，15种主要富集于肌肉，39种主要富集于下丘脑，另外12种则同时富集于上述多个组织（扩展数据图5c）。一种可能的解释是，这些miRNA因被迅速摄取而使其血浆水平低于检测限；另一种可能是，它们通过其他途径发生转运，例如经淋巴管，或由巨噬细胞、神经元等细胞载体介导。

图4. BAT来源miRNA的组织间转运图谱

扩展数据图6. 靶向下丘脑、肌肉和肝脏的BAT来源miRNA（与图4相关）

5、BAT分泌的miRNA在受体组织中发挥功能

为了了解BAT来源miRNA可能调控哪些生物学过程，研究人员基于在肌肉、肝脏和下丘脑中富集的miRNA的预测靶基因，进行了KEGG通路富集分析（图5a）。可以推测的是，BAT来源miRNA在这些组织中靶向最多的是癌症相关通路，miRNA已被认为参与癌症发生发展，并可作为抑癌因子或癌基因发挥作用。然而，被不同组织摄取的miRNA所靶向的通路并不相同。具体而言，富集于肌肉的miRNA主要靶向代谢相关通路中的基因，包括FoxO和胰岛素信号通路，以及与糖尿病并发症相关的基因（图5a）。富集于肝脏的miRNA同样靶向FoxO和TGFβ信号通路，但其靶基因与肌肉富集miRNA并不相同。例如，肌肉富集miRNA主要靶向FoxO、Akt和PTEN，而肝脏富集miRNA则主要靶向Grb/Sos、Pi3K和mTOR相关组分。值得注意的是，富集于下丘脑的BAT来源的miRNA被预测可靶向轴突导向和长期增强作用相关通路，而这些通路并未受到肌肉或肝脏富集miRNA的靶向（图5a）。进一步按照sEV和非sEV两种转运途径对靶向不同组织的miRNA进行分类。发现不同载体途径所携带的miRNA在各组织中还表现出不同的通路靶向特征（扩展数据图7a–c）。例如，在靶向肌肉的miRNA中，与sEV相关的miRNA优先靶向ECM/细胞骨架和细胞连接相关通路，而自噬和cAMP信号通路则主要受到富集于非sEV组分中的miRNA靶向（扩展数据图7a）。这些结果表明，BAT来源miRNA不仅能够选择性富集于特定组织，还可能靶向这些组织中的关键生物学过程。

如上所述，FoxO1是BAT来源miRNA高度靶向的基因之一（图5a）。为了验证这一结果，研究人员将9种转运丰度较高的miRNA模拟物分别转染至C2C12肌肉细胞中。结果发现，其中4种miRNA（包括miR-99b、miR-1a-3p、miR-203-3p和miR-21a-5p）均可显著降低FoxO1蛋白水平，其中miR-1a-3p的作用最为明显，FoxO1蛋白水平下降约80%（P<0.0001）（图5d和扩展数据图8a）。随后，研究人员利用带Flag标签的T6B肽对Ago2–RISC进行pull-down，并结合荧光素酶报告实验，进一步验证miR-1a-3p对Foxo1的直接靶向作用。Ago2–RISC pull-down后，miR-1a-3p和Foxo1 mRNA均明显富集（图5e）；同时，在表达连接Foxo1 3′UTR的荧光素酶报告载体的C2C12细胞中，miR-1a-3p可降低荧光素酶表达（扩展数据图8b）。

由于FoxO1是肌肉线粒体生理功能的重要调控因子，研究人员进一步评估血浆中的BAT来源miRNA是否能够影响细胞呼吸，并选用常用于体外模拟肌肉生理功能的C2C12成肌细胞进行实验。研究人员构建了BAT;DicerKO小鼠，使其BAT中特异性缺失miRNA生物合成。研究人员使用分别加入野生型小鼠或BAT中缺失miRNA的BAT;DicerKO小鼠血浆的条件培养基处理C2C12细胞。结果显示，与BAT;DicerKO小鼠血浆相比，野生型小鼠血浆可显著提高C2C12细胞的基础呼吸和最大呼吸水平（小编注：基础呼吸反映细胞在正常状态下维持基本生命活动所需的线粒体氧耗水平；最大呼吸则通常通过加入解偶联剂，使电子传递链不再受到ATP合成需求的限制，从而测定线粒体能够达到的最高氧耗水平。二者常用于评价线粒体氧化磷酸化功能及细胞的能量代谢状态。）（图5d和扩展数据图7d），提示BAT来源miRNA可能参与促进肌肉细胞呼吸。随后，研究人员进一步关注血浆中丰度较高的几种BAT来源miRNA，将miR-1a-3p、miR-122-5p和let-7a分别转染至C2C12细胞中。结果发现，优先转运至肌肉的miR-1a-3p可显著增强C2C12细胞的细胞呼吸（图5e）。相比之下，优先靶向肝脏的miR-122-5p抑制了最大呼吸，而优先靶向下丘脑的let-7a-5p则对这些细胞的呼吸没有明显影响（图5e和扩展数据图7e）。过表达miR-1a-3p并未改变Foxo1 mRNA水平，这与其通过转录后调控发挥作用相一致。与此同时，线粒体基因表达的重要调控因子PGC1α在mRNA水平（图5f）和蛋白水平上均升高，同时线粒体复合体III和IV蛋白水平也增加（图5f,g和扩展数据图8d,e），最终使C2C12细胞中的ATP生成增加（图5h）。综上，BAT来源的miR-1a-3p可通过抑制肌肉细胞中的FoxO1，促进细胞呼吸并提高PGC1α表达（扩展数据图8f）。

为了进一步在体外验证miRNA的转运，研究人员利用Transwell体系将棕色脂肪细胞与受体肌肉细胞C2C12或肝细胞AML12进行共培养，使彼此分隔，从而仅允许分泌的miRNA发生转运（小编注：Transwell是一种常用的非接触式共培养体系，上下两个培养室之间由具有一定孔径的多孔膜隔开。两类细胞无法直接接触，但细胞分泌的可溶性因子或细胞外囊泡等可以通过膜孔进行交换，因此可用于研究由分泌因子介导的细胞间通讯）。与体内结果一致，共培养24 h后，C2C12和AML12细胞中的miR-1a-3p、miR-122-5p、miR-378a-3p、miR-148a-3p和let-7a-5p均升高约5倍至10,000倍（扩展数据图9a–d）。值得注意的是，miR-148a-3p在AML12细胞中升高近10,000倍，而在C2C12细胞中仅升高约100倍（扩展数据图9b,d），与体内观察到的其优先靶向肝脏的现象一致（图4a）。此外，血浆中相对低丰度的miR-10a-5p以及优先靶向下丘脑的miR-125b-5p在这两类细胞中均未升高，为miRNA存在选择性摄取提供了证据（扩展数据图9）。不过，miR-1a-3p和miR-122-5p在两类细胞中均显著升高，并未表现出体内观察到的组织靶向性。这可能与所使用细胞模型的局限性有关，也可能是由于体外体系缺少某些生理刺激，而这些刺激可能参与促进特定miRNA在特定组织中的富集。

图5. BAT来源miRNA对代谢的调控

扩展数据图7. sEV和非sEV miRNA靶向的通路及BAT来源miRNA对细胞呼吸的调控（与图5相关）

扩展数据图8. miR-1a-3p模拟物转染调控C2C12细胞线粒体功能（与图5相关）

扩展数据图9. 体外共培养和体内BAT刺激验证受体细胞中BAT来源miRNA的上调（与图5相关）

6、BAT来源的miR-1在肌肉中靶向FoxO1并调控线粒体生物发生

细胞外miRNA被受体细胞摄取并装载进入RISC，是miRNA介导组织间基因表达调控的关键步骤，其中RISC可通过miRNA引导Ago2发挥基因沉默作用。为了确定BAT来源miRNA是否能够功能性地装载进入Ago2–RISC，研究人员进行了光活化核糖核苷增强交联免疫沉淀（PAR-CLIP）实验（图7a）。简而言之，通过365 nm紫外光对样品进行交联，可使含4TU的RNA转录本与邻近蛋白中氨基酸残基的芳香环形成交联，从而选择性富集4TU标记的miRNA–蛋白复合物。研究人员对经4TU标记的UCP1; UPRT和UPRTfl/fl小鼠肌肉匀浆进行PAR-CLIP，并利用Flag–T6B肽对Ago2–RISC进行pull-down。结果发现，UCP1; UPRT小鼠肌肉中的4TU标记miR-1a-3p富集约125倍（图7b）。值得注意的是，Foxo1 mRNA同样可在Ago2–RISC中检测到，而Foxo3/4和Gapdh则未被检测到（图7b）。这些结果表明，BAT来源的miR-1a-3p不仅能够在肌肉中富集，还可进入Ago2–RISC，并与其靶基因Foxo1共同存在于肌肉中的Ago2–RISC复合物中。

为了更直接地确定miR-1a-3p是否能够促进肌肉线粒体功能，研究人员将编码miR-1a-3p或scramble对照的质粒转染至雄性野生型和BAT;DicerKO小鼠的右侧腓肠肌，并以同一只小鼠的左腿作为内源性对照。正如预期，与野生型小鼠相比，BAT; DicerKO小鼠肌肉中的miR-1a-3p水平较低，而转染miR-1a-3p后其水平得到部分恢复（图7c）。由于所使用质粒编码的是成熟miR-1a-3p，因此pri-miR-1a-1水平并未发生变化（图7d）。与线粒体功能对肌肉的重要作用一致，BAT; DicerKO小鼠的腓肠肌重量显著低于野生型小鼠（图7e），而转染scramble对照并未改变这一现象。相比之下，与同一只BAT; DicerKO小鼠未转染的对侧腿相比，转染miR-1后腓肠肌重量显著增加19%（图7e和扩展数据图10h）。此外，miR-1转染还可恢复线粒体含量，表现为mtDNA水平升高（图7f），并且在野生型和BAT; DicerKO小鼠腓肠肌的电镜图像中均观察到线粒体面积增加（图7g–i）。与对照组相比，BAT; DicerKO小鼠腓肠肌肌纤维横截面积明显减小（平均面积为2,142 ± 277 μm²，而对照组为3,495 ± 99 μm²），而miR-1转染可部分恢复这一变化（图7i和扩展数据图10i）。最后，BAT;DicerKO小鼠肌肉中升高的FoxO1，在转染miR-1后恢复至正常水平（图7j）。因此，BAT是血浆和肌肉中miR-1a-3p的重要来源之一，但并非唯一来源。BAT来源的miR-1a-3p进入肌肉后可装载至Ago2–RISC，抑制FoxO1翻译，并参与维持线粒体稳态（图7k）。综上表明，BAT可通过sEV和非sEV两种途径分泌多种miRNA，并对肝脏、肌肉和下丘脑等多个组织中原有的miRNA水平产生显著贡献；这些BAT来源miRNA可进一步参与调控胰岛素/FoxO信号通路及其他代谢功能（图8）。

总结

该研究建立了基于4TU/UPRT的BAT特异性RNA标记体系，实现了对BAT来源miRNA在体内分泌和组织间转运过程的系统追踪。研究发现，BAT可通过sEV和非sEV两种途径向循环中分泌多种miRNA，不同miRNA在载体选择及远端组织摄取方面均表现出明显的选择性，并可分别富集于肝脏、肌肉和下丘脑。进一步的功能分析表明，这些BAT来源miRNA不仅能够到达受体组织，还可参与调控其中的代谢相关信号通路。BAT中特异性缺失Dicer后，肌肉中多种BAT来源miRNA明显减少，并伴随线粒体含量下降、PGC1α及线粒体呼吸链复合体蛋白降低等代谢功能异常。机制上，BAT来源的miR-1a-3p可转运至肌肉并装载进入Ago2–RISC，直接靶向FoxO1，进而促进PGC1α表达、线粒体生物发生及细胞呼吸；在BAT;DicerKO小鼠肌肉中恢复miR-1a-3p表达，还可部分改善线粒体含量和肌肉表型。综上，该研究揭示了一个由BAT分泌型miRNA介导的器官间通讯网络，表明BAT来源miRNA可通过选择性的分泌、转运和组织摄取，对远端器官的基因表达及代谢功能产生调控作用。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s42255-026-01558-0

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