Science：胖出来的“炎症炸药包”（下篇）

初稿 | 丁祎楠 

校对 | 生茂正小编注 | 高铭远 生茂正 石丽排版 | 丁祎楠编辑 | 孟美瑶

7、SAMHD1通过抑制mtDNA新生合成和ox-mtDNA的产生来抑制NLRP3的过度激活

研究数据表明，SAMHD1的dNTPase活性能够抑制NLRP3炎性小体的过度激活。为探究这一作用是否依赖mtDNA代谢，研究员首先使用低剂量溴化乙锭处理BMDMs以去除mtDNA（图S7、图S8A和图S8B），结果发现Samhd1^−/− BMDMs中IL-1β的释放、Caspase-1激活以及细胞焦亡水平均显著降低，且该处理并不影响TNF的分泌（图S8C-G）。同样，在Samhd1⁻/⁻斑马鱼模型中，EtBr预处理也消除其体内升高的mtDNA水平及NLRP3炎性小体过度激活的表型（图S8H-K）（小编注：溴化乙锭EtBr可以嵌入DNA，干扰DNA复制，由于mtDNA持续复制且对这种处理比较敏感，因此可用于mtDNA清除。如果长期使用会严重影响斑马鱼发育和生存，但早期斑马鱼胚胎可在低剂量下短期存活）。

为进一步验证，研究人员构建了Tfam^ΔMye小鼠（Lyz2-cre:Tfam^F/F），该模型在髓系细胞特异性敲除TFAM，从而导致mtDNA含量显著降低（图3A、图3B）。在Tfam^F/F和Tfam^ΔMye来源的BMDMs中敲低Samhd1后发现，SAMHD1与TFAM双缺失可显著逆转SAMHD1单缺失导致的NLRP3炎性小体过度活化、半胱天冬酶-1活化、IL-1β分泌与细胞焦亡。（图3C-G）。同时Tfam的缺失不影响对TNF的分泌（图3H）。

图3：SAMHD1通过限制mtDNA新生合成来抑制NLRP3炎性小体的过度激活。

图S7：所示基因在mtDNA qPCR定量中的标准曲线

图S8：通过EtBr消除mtDNA可缓解不同物种间NLRP3炎性小体的过度激活表型。

基于此前发现炎性小体预激活可触发mtDNA合成，研究人员进一步研究了SAMHD1是否调控mtDNA新生合成。与对照组相比，在静息状态下Samhd1^−/− BMDMs中mtDNA含量已略有升高，在LPS刺激后线粒体DNA累积效应进一步增加（图S9A、图S9B）。细胞分馏实验证实Samhd1^−/− BMDMs中mtDNA含量升高仅发生在线粒体组分中，胞质组分中线粒体DNA无明显变化（图S9C-E）。与Samhd1^+/+细胞相比，在LPS预激后Samhd1^−/− BMDMs中有更多EdU掺入到mtDNA中（图S9F），表明SAMHD1敲除巨噬细胞中mtDNA新生合成增强。且新合成mtDNA在NLRP3激活剂刺激下大量释放到胞质（图S9F）。

研究人员分别提取脂多糖预处理、脂多糖联合三磷酸腺苷刺激后的野生型与SAMHD1敲除巨噬细胞的线粒体DNA与胞质DNA并通过凝胶电泳进行分离，结果显示野生型巨噬细胞在炎性小体预刺激过程中合成大量全长mtDNA，而在ATP刺激后，全长mtDNA发生部分降解，在细胞质和线粒体中均出现约500-650bp的DNA片段（图S9G），这可能是由mtROS引起的DNA损伤所致。与野生型对照细胞相比，Samhd1^−/− BMDMs在LPS预刺激后积累的全长mtDNA更多（图S9G）。在ATP刺激后，mtDNA新生合成异常增多，导致线粒体和胞质组分中碎片化mtDNA含量显著升高（图S9G）（小编注：外源高浓度ATP是经典NLRP3炎性小体的第二信号，这些ATP往往由坏死、焦亡和严重膜损伤的细胞所排出。ATP通过激活细胞膜上的P2X7 receptor，诱导K⁺外流、Ca²⁺内流及线粒体应激，导致线粒体ROS（mtROS）大量产生。在该研究中，LPS预处理已使细胞处于预激活状态，ATP进一步诱导线粒体损伤和代谢重编程。由于SAMHD1缺失导致dNTP池扩增，ATP刺激后线粒体DNA聚合酶γ（POLγ）获得更多底物，从而发生异常增强的mtDNA复制。新生mtDNA稳定性较差，更易受到mtROS氧化并发生断裂释放，因此在线粒体和胞质组分中均检测到碎片化mtDNA显著增加（图S9G），最终促进NLRP3过度激活）。

为了验证SAMHD1是否通过抑制mtDNA新生合成来阻断NLRP3过度激活，研究人员在Samhd1^+/+和Samhd1^−/− BMDMs中使用2′,3′-双脱氧胞苷（ddC）进行短期处理，ddC可特异性阻断新生mtDNA合成（小编注：2′,3′-双脱氧胞苷（ddC，zalcitabine）是一种脱氧胞苷类似物。进入细胞后被磷酸化为ddCTP，可被线粒体DNA聚合酶γ（POLγ）掺入正在延伸的mtDNA链中。由于ddC缺失3′-OH基团，后续核苷酸无法继续连接，因此导致DNA链终止，从而抑制新生mtDNA复制。短期低剂量处理时，ddC主要影响mtDNA而非核DNA，原因有三：①POLγ对ddCTP敏感性远高于核DNA聚合酶；②线粒体缺乏完善的核苷酸筛选机制；③成熟BMDMs为终末分化细胞，基本不增殖，核DNA复制需求极低。因此该实验条件下ddC被广泛视为“相对特异性mtDNA复制抑制剂”，主要用于阻断新生mtDNA生成。）。结果显示，ddC处理不影响细胞已有mtDNA，但可完全抑制LPS诱导的mtDNA新生合成，进而逆转SAMHD1缺失导致的dNLRP3炎性小体过度激活（图3I-M、图S9H）。以上结果表明，SAMHD1在炎性小体预激过程中可显著限制mtDNA的新生合成。

已有研究证实新合成的mtDNA是ox-mtDNA的主要来源（小编注：该观点主要来源于Shimada et al. Nature 2012。研究发现，NLRP3激活过程中并非随机释放的全部mtDNA都具有促炎活性，而是新复制产生的mtDNA更容易受到ROS氧化。新生mtDNA通常位于线粒体核样体外围，尚未被TFAM等蛋白充分包装保护，因此更易暴露于氧化环境形成氧化mtDNA（ox-mtDNA）。这些ox-mtDNA片段释放至胞质后可直接结合NLRP3并增强炎性小体组装。抑制mtDNA复制（如应用ddC或抑制POLγ）可显著减少ox-mtDNA产生，同时降低Caspase-1活化和IL-1β释放。因此，新生mtDNA并非单纯复制产物，而是NLRP3炎性小体激活过程中最重要的促炎mtDNA来源之一），且研究人员观察到在NLRP3激活剂刺激下，Samhd1^−/− BMDMs中线粒体及其胞质中的ox-mtDNA水平均显著升高（图2V、图2W），因此推测抑制mtDNA氧化及其向胞质转位能够改善SAMHD1缺失介导的NLRP3炎性小体的过度激活。

在NLRP3激活剂刺激下，Samhd1^−/− BMDMs产生的mtROS显著高于野生型细胞（图S10A）。而在BMDMs中过表达野生型SAMHD1可有效抑制NLRP3激活剂诱导的mtROS产生（图S10B）。使用线粒体特异性ROS清除剂Mito-TEMPO预处理细胞可显著抑制Samhd1^−/− BMDMs中NLRP3炎性小体的激活，且不影响TNF分泌（图S10C-E）。

ox-mtDNA特异性抑制剂8-OH-dG可竞争性阻断氧化型线粒体DNA与NLRP3的结合。用8-OH-dG预处理Samhd1^−/− BMDMs，也可以剂量依赖方式抑制NLRP3炎性小体过度激活，且不影响TNF分泌，（图S10F-L）。相比之下，使用8-OH-dG的非氧化对应物dG预处理则不能抑制炎性小体的过度激活（图S10F-L）。此外，阻断mPTP和VDAC通道可抑制ox-mtDNA向胞质释放，有效挽救SAMHD1敲除细胞的炎症过度活化表型，且不影响TNF分泌（图S10M-P）。综上所述：SAMHD1通过限制mtDNA的新生合成、减少ox-mtDNA的产生、阻断氧化型线粒体DNA胞质释放，进而抑制NLRP3炎性小体的组装，从而防止其过度激活。

图S9：SAMHD1防止了巨噬细胞中mtDNA的过度合成以及向细胞质的释放

图S10：增加的ox-mtDNA导致了SAMHD1缺失型巨噬细胞中NLRP3炎性小体的过度激活

8、胞质dNTP向线粒体的输入驱动NLRP3炎性小体的过度激活。

巨噬细胞是终末分化的静止期细胞，其细胞内的dNTP被线粒体双层膜分隔为胞质dNTP库和线粒体dNTP库两个独立的dNTP库。SAMHD1作为细胞内最主要的dNTP水解酶，可通过降解四种脱氧核苷酸来维持胞质中dNTP处于较低水平。研究发现，无论是否经过炎症预激活，与Samhd1^+/+ BMDMs相比，Samhd1^−/− BMDMs中四种dNTP的水平均显著升高（图4A-H、图S12A和图S12B）。

图4：在SAMHD1缺失的巨噬细胞中，胞质dNTP向线粒体的输入驱动NLRP3炎性小体的过度激活。

正常生理状态下野生型巨噬细胞线粒体DNA复制所需的脱氧核苷三磷酸完全依赖补救合成途径来提供，其中CMPK2是炎性小体预激活过程中mtDNA新生合成的关键限速酶。研究人员发现，在炎性小体预激前后，Samhd1^−/− BMDMs中CMPK2的表达水平与Samhd1^+/+细胞无明显差异（图S11A）。与先前报道一致，在Samhd1^+/+ BMDMs中敲低Cmpk2会抑制Caspase-1活化、IL-1β分泌以及细胞焦亡，而不影响TNF（图S11B-F）。但在Samhd1^−/− BMDMs中沉默Cmpk2无法改善这些炎症表型（图S11B-F）。

研究人员构建了Samhd1和Cmpk2双敲除小鼠，并比较了同窝野生型、单基因敲除以及双基因敲除小鼠来源BMDMs中的NLRP3炎性小体活性。发现在SAMHD1功能正常的BMDMs中，CMPK2的缺失会显著抑制炎性小体活化（图S11G-J），但在SAMHD1缺失的细胞中，CMPK2缺失无法抑制NLRP3炎性小体的过度激活（图S11G-J）。

鉴于SAMHD1缺失会导致dNTP异常积累（图4A-H、图S12A和图S12B），研究人员推测这些积累的dNTP可以通过线粒体核苷酸转运蛋白从胞质进入线粒体，从而绕过CMPK2介导的线粒体dNTP补救途径，直接为mtDNA新生合成提供底物。于是研究人员在BMDMs中敲低了线粒体核苷酸转运蛋白——嘧啶核苷酸载体1/2（Pyrimidine nucleotide carrier 1/2,PNC1/2）（图S13A）,结果显示，在Samhd1^+/+ BMDMs中，敲低PNC1/2对线粒体或胞质dNTP库均无显著影响；但在Samhd1^−/− BMDMs中，PNC1/2缺失会导致线粒体内四种dNTP水平均显著下降（图4I-L）。在Samhd1^−/− BMDMs中，线粒体dNTP含量显著降低后，SAMJD1缺失介导的NLRP3炎性小体过度激活表型被逆转（图4M-O）。此外，在阻断胞质dNTP向线粒体转运后，Samhd1^−/− BMDMs中的mtDNA新生合成水平降低至与Samhd1^+/+ BMDMs相似的水平（图S13B-F）。这表明，抑制胞质dNTP进入线粒体可阻止Samhd1^−/− BMDMs中NLRP3炎性小体的过度激活，在SAMHD1缺陷状态下，mtDNA新生合成主要依赖从胞质转运至线粒体的dNTP，而不依赖CMPK2介导的补救途径。

研究人员在野生型小鼠BMDMs的培养基中补充过量脱氧核苷（dNs），这些分子在进入细胞后可被细胞摄取并转化为dNTP，结果显示外源补充dNs可显著促进炎性小体预激活过程中mtDNA新生合成，并在NLRP3激活剂刺激下进一步增强Caspase-1活化和IL-1β分泌，而不影响pro-IL-1β或TNF分泌水平（图4P-T）。补充dNs可消除野生型与SAMHD1缺失巨噬细胞之间在mtDNA新生合成及NLRP3炎性小体激活方面的差异（图4P-T）。以上结果证实点：SAMHD1通过限制细胞内dNTP的积累来抑制NLRP3炎性小体的激活。

图S11：在SAMHD1缺失的巨噬细胞中，CMPK2不再控制NLRP3炎性小体的激活。

图S12：通过HPLC测定的多批次巨噬细胞dNTP定量数据

图S13：阻断dNTP从细胞质流入线粒体，从而抑制了SAMHD1缺陷巨噬细胞内mtDNA的过度合成

9、SAMHD1在体内抑制NLRP3依赖性的免疫病理损伤

为了评估SAMHD1在体内对NLRP3炎性小体激活的抑制作用，研究人员利用三种经典的NLRP3依赖性急性炎症模型对将Samhd1^+/+和Samhd1^−/−小鼠进行体内功能验证：（i）LPS诱导的脓毒症，（ii）明矾诱导的腹膜炎，（iii）D-半乳糖胺联合LPS诱导的暴发性肝炎。在脓毒症模型中，腹腔注射LPS后，Samhd1^−/−小鼠血清IL-1β水平显著升高，TNF水平无明显变化，小鼠死亡率显著上升（图S14A-C）。而通过给予NLRP3特异性抑制剂MCC950预处理可有效逆转SAMHD1敲除导致的IL-1β异常升高表型（图S14A）。

在明矾诱导的腹膜炎模型中，Samhd1^−/−小鼠腹腔IL-1β水平、中性粒细胞与单核细胞浸润显著增加（图S14D-G）。同时研究人员设置酵母聚糖诱导腹膜炎模型作为对照，酵母聚糖为TLR2激动剂，可不依赖NLRP3通路诱发炎症，结果显示不同基因型小鼠之间免疫细胞浸润程度无显著差异（图S14H、图S14I），从而排除了SAMHD1缺失导致固有免疫细胞迁移缺陷的可能性。在D-半乳糖胺联合LPS介导的爆发性肝炎模型中，Samhd1^−/−小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）升高、肝损伤加重、肝脏巨噬细胞中Caspase-1活化水平显著增强（图S14J-L）。综上得出结论：SAMHD1在显著抑制体内NLRP3炎性小体的过度激活，有效减轻炎症介导的组织病理损伤，保护机体免受炎症相关病理损伤。

图S14：SAMHD1在体内抑制NLRP3炎性小体的激活

10、SAMHD1保护小鼠免受肥胖诱发的代谢紊乱

为探究巨噬细胞中SAMHD1在肥胖中的作用，研究人员通过将携带loxP位点的Samhd1 flox小鼠与Lyz2-Cre工具鼠杂交，构建了髓系细胞特异性SAMHD1敲除小鼠（Samhd1^ΔMye）。通过对Samhd1^F/F和Samhd1^ΔMye小鼠进行24周的高脂饮食喂养发现，两组小鼠的体重和体成分无显著差异（图S15），但Samhd1^ΔMye小鼠出现了明显的胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良（图5A、图5B）。此外，Samhd1^ΔMye小鼠血清中肥胖相关的炎症标志物IL-1β水平显著升高而TNF水平没有变化（图5C-D）。HFD喂养的Samhd1^ΔMye小鼠的ATMs中dNTP和mtDNA水平显著升高（图5E-J、图S12C和图S12D），同时细胞氧化磷酸化增强（图S16A、图S16B），但线粒体总量未发生显著变化（图S16C-G）。

图5：SAMHD1保护小鼠免受肥胖诱导的代谢综合征。

图S15：高脂饮食（HFD）喂养后Samhd1^F/F和Samhd1^ΔMye小鼠的体重与体成分

图S16：SAMHD1缺陷促进OXPHOS，但不影响线粒体质量

SAMHD1可在巨噬细胞与中性粒细胞中同时表达，Samhd1^ΔMye小鼠在巨噬细胞和中性粒细胞中均特异性缺失SAMHD1，然而，SAMHD1缺失并未影响中性粒细胞分泌IL-1β或TNF的能力，也未改变其mtDNA含量（图S17A-D）。已有研究报道SAMHD1可抑制病毒诱导的I型干扰素应答，但研究人员发现在高脂饮食干预前后，Samhd1^F/F和Samhd1^ΔMye小鼠中均未检测到循环中的I型IFNs（图S17E）。此外HFD喂养24周后，脂肪和肝脏组织中的I型IFN基因（如Ifnα4/Ifnβ）或干扰素刺激基因（ISGs）的表达也未发生变化（图S17F、图S17G）。上述结果证实I型IFN信号通路并不参与介导Samhd1^ΔMye小鼠的代谢异常表型。

与血清IL-1β升高的炎症表型一致，Samhd1^ΔMye小鼠肝脏中活化的Caspase-1升高（图5K、图5L），且胰岛素信号通路关键分子AKT的磷酸化水平降低（图5M、图5N），提示胰岛素信号传导受损。经过24周高脂饮食喂养后，Samhd1^ΔMye小鼠还表现出肝脏甘油三酯含量升高（图5O）、血清ALT与AST水平升高（图5P、图5Q）、肝脏炎症加重与纤维化程度加重，表现出典型的肥胖相关代谢性肝损伤表型（图5R-U）。

全身性SAMHD1缺失（Samhd1^−/−）小鼠的代谢紊乱表型与髓系特异性敲除小鼠基本一致，但肝脂肪变性无显著变化（图S18）。与之相反，Cmpk2^−/−小鼠在高脂饮食条件下的代谢水平与炎症反应均与野生型同窝对照小鼠无显著差异（图S19），进一步证实肥胖驱动的核苷酸代谢重编程可绕过CMPK2经典补救合成途径。同时CMPK2缺失可显著缓解明矾诱导的腹膜炎（图S20），表明CMPK2在非肥胖背景下调控NLRP3炎性小体的激活，不参与肥胖相关炎症与代谢紊乱进程。

图S17：SAMHD1缺陷小鼠的代谢失调独立于中性粒细胞来源的IL-1β或全身性I型干扰素

图S18：Samhd1的胚系缺失加速了小鼠肥胖诱导的代谢疾病发展。

图S19：CMPK2缺陷不影响肥胖诱导的代谢疾病发展

图S20：CMPK2在健康小鼠中调控NLRP3炎性小体的激活

11、阻断dNTP向线粒体的输入可缓解肥胖诱导的NLRP3过度激活

基于上述研究结果，研究人员提出假设：阻断线粒体对dNTP的摄取可以逆转人类免疫细胞中由SAMHD1缺失所导致的NLRP3炎性小体过度激活。临床样本检测结果显示，与瘦个体相比，肥胖个体来源的CD14⁺单核细胞中dNTP水平显著升高（图6A-L、图S12E和图A12F）。在人单核细胞源性巨噬细胞中通过CRISPR介导删除PNC1/2后能够显著降低mtDNA新生合成、Caspase-1激活、IL-1β分泌以及细胞焦亡，同时不影响TNF水平（图6M-S）。综上表明：肥胖诱导的NLRP3过度激活主要源于SAMHD1功能失活，并且可以通过靶向抑制线粒体dNTP转运来缓解肥胖相关的炎症过度激活表型。（图S21）。

图6：阻断dNTP向线粒体的输入可消除肥胖诱导的NLRP3过度激活。

图S21：肥胖重塑巨噬细胞核苷代谢，以驱动NLRP3炎性小体的过度活化

总结

本研究发现，肥胖可通过诱导SAMHD1磷酸化并削弱其 dNTP 水解功能，破坏巨噬细胞核苷酸稳态，导致胞质dNTP异常蓄积并进入线粒体，促进线粒体DNA新生合成和氧化型mtDNA积累，从而触发NLRP3炎性小体过度活化及IL-1β过量分泌。SAMHD1缺失在斑马鱼、小鼠和人源细胞中均可增强NLRP3 炎症反应，并使小鼠出现循环IL-1β升高、胰岛素抵抗和代谢相关脂肪性肝炎；而阻断dNTP向线粒体转运可抑制肥胖患者及SAMHD1缺陷小鼠巨噬细胞中的NLRP3过度活化。该研究揭示了肥胖诱导慢性炎症的新机制，并提示靶向SAMHD1-dNTP-mtDNA轴或dNTP线粒体转运，可能为干预肥胖相关代谢疾病提供新的治疗思路。

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