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Science：胖出来的“炎症炸药包”（上篇）

已有 205 次阅读 2026-9-21 21:47 |系统分类:科研笔记

Science：胖出来的“炎症炸药包”（上篇）

初稿 | 丁祎楠

校对 | 生茂正小编注 | 高铭远生茂正石丽排版 | 丁祎楠编辑 | 孟美瑶

肥胖症目前已成为重大公共卫生危机，在发达国家尤为高发，已然成为一项严峻的公共卫生难题。肥胖会促进2型糖尿病、代谢功能障碍相关性脂肪性肝病、心血管疾病、神经退行性疾病及癌症等多种慢性疾病的发生发展。慢性低度炎症是肥胖的标志性特征，表现为机体持续分泌低水平促炎细胞因子，引发持续性炎症翻译，加剧肥胖相关疾病的发生与进展。然而，肥胖促进炎症调控紊乱的具体分子机制尚未阐明。

无菌性炎症是指机体在无病原体入侵的条件下，因组织内环境稳态失衡所触发的炎症反应，其发生主要依赖天然免疫感受器——NLRP3炎性小体的活化。巨噬细胞中NLRP3炎性小体的异常激活会通过半胱天冬酶-1（Caspase-1）介导的蛋白水解剪切作用，将无活性的白介素-1β、白介素-18前体剪切为成熟的活性细胞因子，进而启动并放大炎症反应，这一机制也是肥胖相关各类并发症发生的重要诱因。例如促炎细胞因子IL-1β可以干扰胰岛素β细胞的胰岛素信号传导，导致胰岛素抵抗，从而驱动全身性代谢失调和2型糖尿病的发展。在肝脏中，肥胖诱导产生的IL-1β可以启动促炎细胞因子信号级联反应，最终破坏巨噬细胞的胞葬作用，诱发肝脏持续性慢性炎症，导致良性脂肪肝逐步发展为代谢相关脂肪性肝炎、肝硬化，甚至肝细胞癌。

线粒体是调控NLRP3炎性小体激活的关键细胞器。脂多糖、聚肌胞苷酸等预激活信号（小编注：脂多糖是细菌糖蛋白，聚肌胞苷酸Poly(I:C)是人工合成的双链RNA类似物，主要用来模拟病毒感染过程中产生的双链RNA。LPS更偏向模拟革兰氏阴性菌感染，Poly(I:C)更偏向模拟病毒感染。本文中，LPS单独处理可以诱导NLRP3、pro-Il-1b等表达，但无法继续引发成熟Caspase-1和Il-1β的切割和释放。），不仅能诱导IL-1β前体从头合成、上调NLRP3蛋白表达，还可提升胞苷单磷酸激酶2（Cytidine monophosphate kinase 2,CMPK2）的表达水平。CMPK2是线粒体脱氧核苷三磷酸（dNTP）补救合成途径的限速酶，可为巨噬细胞线粒体DNA（mtDNA）的从头合成提供必需的原料。在炎性小体激活阶段，当巨噬细胞受到三磷酸腺苷（ATP）、微生物毒素、颗粒性物质等NLRP3激活剂刺激时，线粒体结构与功能受损（小编注：ATP是细胞外ATP，在体内通常来自受损的细胞或炎症组织。这些ATP可结合在巨噬细胞表面的P2X7受体上，引发钾离子外流，从而进一步促进NLRP3组装等下游影响。本文的主要处理条件为LPS200ng/mL 4h后，加入ATP 4mM 45min。LPS等毒素可以破坏质膜完整性引起细胞渗透压改变，增加线粒体电子传递链压力。而颗粒性物质/微晶等则容易造成巨噬细胞溶酶体肿胀破裂，释放ROS等引发氧化应激失衡，从而造成线粒体受损），产生大量的线粒体活性氧（mtROS），与机体内已稳定存在的线粒体DNA相比，新合成的线粒体DNA尚未被线粒体转录因子A（Transcription factor A, mitochondria, TFAM）包装为成熟的类核结构（小编注：新合成的mtDNA并非任何时候都大量存在，通常线粒体内部有少量mtDNA生成，但不足以触发炎性小体。在本文中，作者发现当Samhd1缺失时，dNTP代谢失衡导致大量dNTP进入线粒体，推动mtDNA过度合成，从而激活NLRP3），因此更容易被线粒体活性氧氧化损伤，从而成为细胞内氧化型线粒体DNA（ox-mtDNA）的主要来源（小编注：ox-mtDNA的核心作用为损伤相关的分子模式(Damage associated molecular patterns, DAMPs)，通常主要作为线粒体损伤、组织感染的报警机制发挥作用，但在肥胖、神经炎症等状态下，ox-mtDNA会导致病理性无菌炎症）。氧化损伤的线粒体DNA会被线粒体FEN1核酸内切酶剪切为短片段（小编注：FEN1只识别ox-mtDNA吗？机制是什么？）（答：FEN1全名为Flap endonuclease 1，是一个结构特异性的核酸内切酶，可以识别并DNA修复过程中的5’flap、gap、nick和结构异常DNA，并非只能影响ox-mtDNA），随后通过线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore,mPTP）、电压依赖性阴离子通道（Voltage-dependent anion channel,VDAC）以及BAK/BAX孔道释放至细胞质中。片段化的氧化型线粒体DNA可特异性结合并激活NLRP3蛋白（小编注：正常mtDNA泄露本身也属于异常的胞质核酸信号，但未氧化mtDNA更可能激活 cGAS-STING/TLR9等其他通路，不足以触发炎性小体；对NLRP3来说，更关键的是mtDNA被氧化形成ox-mtDNA。ox-mtDNA通过与NLRP3结合，促进 NLRP3-ASC-caspase-1炎性小体组装，而不是单纯因为有mtDNA泄露就一定强烈激活NLRP3），促进炎性小体复合物组装，最终通过Caspase-1通路介导IL-1β的成熟与分泌，启动炎症应答。

拓展阅读：dNTP 合成途径

dNTP是DNA复制与修复的直接原料。在体内，细胞主要通过“从头合成”和“补救合成”两种方式维持dNTP供应。其中，从头合成途径以葡萄糖、谷氨酰胺、天冬氨酸等为原料，先合成核糖核苷酸，再经核糖核苷酸还原酶转化为脱氧核苷酸，最终生成dATP、dGTP、dCTP和dTTP。

补救合成途径则是回收已有的碱基、核苷或脱氧核苷，通过激酶逐步磷酸化重新生成dNTP。线粒体由于内膜屏障形成相对独立的dNTP池，因此在巨噬细胞这类低增殖细胞中，mtDNA的复制和修复更依赖线粒体局部的补救途径。在补救途径中，CMPK2起到了重要的作用，即将这些单磷酸嘧啶核苷酸进一步磷酸化为NDP/dNDP，并最终生成NTP/dNTP用于mtDNA合成。

在炎症状态下，LPS等炎症信号可以通过TLR4激活MyD88/TRIF通路，上调CMPK2的表达，为mtDNA的新生合成提供dNTP原料。新生成的mtDNA由于尚未被TFAM包装保护，因此更容易被氧化形成ox-mtDNA促进NLRP3炎性小体的组装，激活Caspase-1，最终切割pro-Il-1β生成成熟的IL-1β。

参考文献：

[1] Zhong Z, et al. Nature. 2018 Aug;560(7717):198-203.

基于上述背景，美国德克萨斯大学西南医学中心（UT Southwestern Medical Center）免疫学系仲振宇团队在Science发表研究论文Nucleotide metabolic rewiring enables NLRP3 inflammasome hyperactivation in obesity，本研究旨在探究肥胖是否通过调控代谢疾病的核心炎症介质NLRP3炎性小体来诱发炎症紊乱，并深入探究肥胖改变巨噬细胞炎性小体活化的分子机制，旨在挖掘能够改善肥胖相关炎症的潜在治疗靶点，为肥胖并发症的干预提供新的理论依据。

敲黑板啦！

1、肥胖通过激活NLRP3炎性小体，驱动巨噬细胞慢性炎症

2、肥胖通过抑制SAMHD1功能，导致细胞内dNTP异常积累并促进线粒体DNA及其氧化产物的生成

3、ox-mtDNA是触发NLRP3炎性小体过度激活的关键分子

4、阻断dNTP进入线粒体可逆转炎性小体过度激活，具有潜在治疗价值

1、肥胖触发NLRP3炎性小体的过度激活

为探究肥胖对人类NLRP3炎性小体激活的影响，研究人员从瘦个体（BMI≤25kg/m²）以及肥胖患者（BMI≥40kg/m²）中获取原代外周血单个核细胞（PBMCs），并分离出CD14⁺单核细胞，在将这些细胞诱导分化为单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）后进行功能验证发现，经NLRP3激活剂刺激后，与瘦个体相比，肥胖患者来源的巨噬细胞成熟IL-1β分泌水平显著升高，半胱天冬酶-1活化程度更高，细胞焦亡相关指标也明显上调（图1A-D）。而两组人群巨噬细胞肿瘤坏死因的分泌水平、NLRP3炎性小体各组分蛋白表达以及pro-IL-1β的基础表达均无显著变化（图1B-C）。研究人员同时使用HFD喂养C57BL/6小鼠构建肥胖模型，取其骨髓来源的巨噬细胞进行检测发现，与ND组小鼠相比，小鼠来源的细胞相比，高脂饮食肥胖小鼠的骨髓源性巨噬细胞也表现出NLRP3炎性小体的过度激活表型（图1E-G）。(小编注：NLRP3是多种蛋白组成的复合小体，为什么图1的WB中NLRP3是一条带？)（答：NLRP3炎性小体主要包括NLRP3、ASC、pro-Caspase-1等，通常WB实验中蛋白会被SDS变性，复合体被拆开，因此可以检测其核心NLRP3单体蛋白。此外，文中也检测了ASC和pro-Caspase-1）

图1：肥胖诱导人体和小鼠巨噬细胞中NLRP3炎性小体的过度激活

此外，HFD小鼠的原代腹腔巨噬细胞（PMs）的NLRP3炎性小体激活水平也同样显著高于正常饮食小鼠（图1H-J）。相比之下，由脂多糖（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞中肿瘤坏死因子的产生不受饮食性肥胖的影响（图1F、图1I）（小编注：IL1b通常依赖于炎性小体激活，而TNF则更多代表TLR/NF-κB通路。其中，TNF分泌速度更快，在LPS刺激后即刻开始释放分泌，而IL1b的分泌则包括LPS刺激pro-IL-1β，以及NLRP3炎性小体中的Caspase-1裂解pro-IL-1β生成成熟IL-1β。在本文中，HFD组的BMDMs和PMs在LPS+ATP后IL-1β显著上调，但TNF无显著差异，说明肥胖主要增强的不是TLR4通路，而是更偏向NLRP3炎性小体通路）。基于此研究人员认为：肥胖会显著促进人体和小鼠中NLRP3炎性小体的过度激活，进而导致IL-1β大量分泌。

2、肥胖诱导的NLRP3过度激活依赖于线粒体DNA。

接下来研究人员进一步探究了肥胖状态下巨噬细胞中NLRP3炎性小体过度激活的分子机制。已有研究表明线粒体损伤及随后产生的氧化型mtDNA（ox-mtDNA）是驱动NLRP3炎性小体激活的关键环节，因此研究人员首先评估了mtDNA的丰度及其氧化程度。结果显示，与瘦对照相比，肥胖个体来源的CD14⁺单核细胞中mtDNA含量显著升高（图S1A、图S1B）。经LPS诱导炎性小体预激活后肥胖患者单核细胞分化而来的巨噬细胞仍持续维持更高的线粒体DNA水平（图S1C、图S1D）。同时在ATP刺激后，从肥胖个体分离的人源MDMs中ox-mtDNA的生成显著上调（图S1E）。（小编注：D-LOOP/TERT和16S/B2M都是用来定量mtDNA的。前者是mtDNA的非编码区，后者代表线粒体16S rRNA区域。TERT和B2M是核基因，用于内参。mtDNA 8-OH-dG中，8-OH-dG是DNA的鸟嘌呤被ROS氧化的经典Marker，该指标生检测mtDNA的氧化损伤程度。这些结果表明：肥胖来源细胞的mtDNA总量更多，氧化程度更高）

本研究通过两种方式干预线粒体DNA稳态：通过使用溴化乙锭（EtBr）清除细胞内mtDNA（图S1F-L），或通过遗传方式敲除TFAM基因（图S1M-S），结果发现两种方法均可减轻肥胖个体来源人MDMs中mtDNA增加、ox-mtDNA积累以及NLRP3炎性小体的过度激活。已有报道表明8-羟基-2’-脱氧鸟苷（8-OH-dG）可竞争性阻断ox-mtDNA与NLRP3结合，提前用该药物处理肥胖患者来源的巨噬细胞，可显著缓解肥胖个体来源人MDMs中的NLRP3炎性小体过度激活，同时也会影响TNF的分泌（图S1T-V）。

上述结果证实：mtDNA是肥胖诱导的NLRP3炎性小体过度激活中的关键因素，同时排除了炎性小体组分编码基因发生获得性功能增强型体细胞突变介导的该高活性表型的可能性。

图S1：肥胖诱导的NLRP3炎性小体过度激活依赖于mtDNA。

3、线粒体核苷酸补救途径不参与肥胖诱导的NLRP3过度激活

为探究肥胖如何导致巨噬细胞中mtDNA异常累积，研究人员首先检测了负责mtDNA复制的酶——DNA聚合酶γ（POLγ）的表达。结果显示，在人类CD14⁺单核细胞中，瘦个体与肥胖个体之间POLγ两个亚基（POLG1/G2）的表达水平无显著差异（图S2A和B）。同时其他对mtDNA合成至关重要的因子，如线粒体单链DNA结合蛋白（Mitochondrial single-stranded DNA binding protein,mtSSB）、TWINKEL以及CMPK2的表达也未发生变化（图S2A-D）。

进一步功能验证发现，利用CRISPR/Cas9技术敲除肥胖患者巨噬细胞的CMPK2基因后细胞mtDNA新生合成或ox-mtDNA的生成均未受到影响，且NLRP3炎性小体的高敏活化状态也未得到改善（图S2E-K）。相比之下，在瘦体个体来源的MDMs中敲除CMPK2，可显著抑制mtDNA新生合成、ox-mtDNA产生以及NLRP3炎性小体的激活（图S2E-K）。

以上结果表明：CMPK2介导的核苷酸合成仅在瘦体个体的巨噬细胞中参与NLRP3炎性小体的激活，而在肥胖个体中则无调控作用。这一发现促使研究人员将重点转向探究肥胖是否通过扰乱核苷酸分解代谢来介导炎性小体的异常激活（小编注：核苷酸合成还存在常规的从头合成途径，由RNR等酶将核糖核苷酸还原为脱氧核苷酸。但该途径主要发生在胞质，且在巨噬细胞这种终末分化的细胞中不活跃，因此作者认为线粒体dNTP供应主要依赖CMPK2介导的补救途径。这一部分的实验表明，肥胖时mtDNA增多，但是mtDNA复制的酶没上调，且CMPK2补救合成也没有影响，那么问题可能在于dNTP消耗被抑制造成的dNTP累积从而被用于合成mtDNA，SAMHD1是dNTP的核心水解酶，因此作者后续开始研究核苷酸分解和SAMHD1。）。

图S2：由CMPK2介导的核苷酸补救合成对肥胖诱导的NLRP3炎性小体过度激活并非必需。

4、肥胖抑制SAMHD1功能

SAM和HD结构域蛋白1(SAM and HD domain–containing protein 1,SAMHD1)是进化上高度保守的dNTP水解酶，也是调控细胞内dNTP分解代谢的主要调控因子。SAMHD1可在脱氧鸟苷三磷酸（dGTP）的激活下，将四种类型的dNTP水解为相应的脱氧核苷（dNs）和无机三磷酸，从而维持细胞内dNTP的稳态。研究人员检测了瘦个体和肥胖个体来源的单核细胞及MDMs中的SAMHD1表达水平，结果发现两组细胞的SAMHD1总蛋白及mRNA表达水平无显著差异（图2A–D）。

拓展阅读：SAMHD1 与 dNTP 水解：核苷酸稳态

SAMHD1是细胞内重要的dNTP 水解酶，主要作用是清除过量dNTP。SAMHD1的活性依赖同源四聚体形成，并受到dGTP等核苷酸的别构激活。而当SAMHD1发生磷酸化后会抑制抑制活性四聚体形成。激活后，SAMHD1可水解四种dNTP，将其转化为相应的脱氧核苷和无机三磷酸，从而降低细胞内 dNTP 池水平。该反应式可概括为：dNTP + H₂O → dN + PPPi。

本文发现，与瘦个体相比，肥胖个体来源的单核细胞和MDMs中SAMHD1的表达量没有显著差异，但p-SAMHD1升高、SAMHD1四聚体减少，说明肥胖主要不是降低SAMHD1表达，而是通过磷酸化破坏其四聚体组装，从而抑制 dNTPase功能。

图2：肥胖可抑制SAMHD1功能，且SAMHD1从鱼类到人类均发挥抑制NLRP3炎性小体过度活化的作用

SAMHD1需形成同源四聚体复合物才能发挥脱氧核苷三磷酸酶（dNTPase）功能，而该四聚体的形成过程受到磷酸化修饰的精密调控。在人类中，单体SAMHD1第592位苏氨酸（小鼠中为第603位苏氨酸）发生磷酸化后会抑制其四聚体的组装，从而导致其水解酶活性的丧失。研究人员发现，与瘦体对照相比，肥胖个体来源的单核细胞中磷酸化SAMHD1水平显著升高，同时SAMHD1四聚体的形成减少（图2C-G），表明肥胖会抑制人类单核细胞中SAMHD1的功能。在来源于肥胖个体的PBMC来源MDMs中，也观察到类似的SAMHD1四聚体形成缺陷（图2H）。

研究人员进一步在动物模型中验证该机制发现，与对照小鼠相比，HFD喂养小鼠脂肪组织相关巨噬细胞中p-SAMHD1水平升高且SAMHD1四聚体形成减少（图2I-M）。而不同饮食小鼠来源的ATMs中，总SAMHD1水平没有变化（图2I、图2J和图2N）。

因此，这些结果表明，肥胖可通过诱导SAMHD1磷酸化抑制人和小鼠的髓系细胞中SAMHD1的蛋白功能。

5、SAMHD1抑制NLRP3炎性小体的过度激活

为了探究SAMHD1在NLRP3炎性小体激活中的潜在调控作用，研究人员从Samhd1^+/+和Samhd1^−/−小鼠中分离了骨髓来源巨噬细胞，在体外用LPS预刺激后，用多种NLRP3激活剂处理，当用ATP、尼日利亚菌素、DOTAP脂质体以及明矾微晶等NLRP3激活剂刺激时，与Samhd1^+/+细胞相比，Samhd1^−/− BMDMs中IL-1β的分泌量增加了2到3倍，而TNF的分泌未发生变化（图2O、图S3A）。

在炎性小体预激活过程中SAMHD1缺失并不影响NLRP3炎性小体组分或pro–IL-1β的表达（图S3B）（小编注：炎性小体的激活主要分为两步，在预激活（Signal 1）中，通常使用LPS处理诱导NLRP3、pro-IL-1β等原料表达，在本文中为200ng/mL LPS处理4h。之后再开始激活步骤（Signal 2）加入ATP、nigericin等NLRP3的激活因子，促使炎性小体组装。这里的意思是SAMHD1确实没有影响Signal 1的进展）。但在NLRP3激活剂刺激后，Samhd1^−/− BMDMs中依赖于NLRP3的含CARD结构域的凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC）寡聚化及斑点形成显著增强（图2P-R）。同时，SAMHD1缺失会进一步增强Caspase-1的活化水平，表现为活化型Casp1 p20蛋白表达增加、FLICA探针检测的活化Caspase-1信号增强以及Caspase-1依赖性的细胞焦亡增强（图2S-U）。与野生型对照细胞相比，Samhd1^−/− BMDMs中ox-mtDNA的产生及其向胞质释放均显著增加（图2V、图2W）。

此外，SAMHD1缺失同样会增强细胞内LPS诱导的非经典NLRP3炎性小体激活（图S3C、图S3D）。而针对NLRC4和AIM2炎性小体的特异性激活实验显示，鞭毛蛋白激活的NLRC4炎性小体、聚脱氧腺苷酸-脱氧胸苷酸转染激活的AIM2炎性小体均不受SAMHD1缺失的影响（图S3E、图S3F），表明SAMHD1对NLRP3炎性小体具有特异性调控作用。同时敲低人源原代MDMs中的SAMHD1同样导致ox-mtDNA生成增加和NLRP3炎性小体的过度激活（图2X、图S3G-J）。

拓展阅读：非经典NLRP3炎性小体激活

非经典NLRP3炎性小体是机体先天免疫系统识别胞内革兰阴性菌感染的重要防御机制，与经典NLRP3炎性小体依赖NLRP3直接感知危险信号不同，其激活首先依赖胞质内LPS对炎症性半胱天冬酶的直接激活。小鼠中主要涉及Caspase-11，人类中则对应Caspase-4和Caspase-5。当革兰阴性菌侵入细胞或细菌外膜囊泡将LPS递送至胞质后，LPS可直接结合Caspase的CARD结构域，引发其寡聚化和自激活。

被激活的Caspase并不直接切割pro-IL-1β和pro-IL-18，而是优先裂解Gasdermin D蛋白（GSDMD）。裂解后的GSDMD-N端片段转位至细胞膜并形成跨膜孔道，导致细胞渗透压失衡，诱导一种炎症性程序性细胞死亡方式，即细胞焦亡（Pyroptosis）。与此同时，GSDMD形成的膜孔促进细胞内K⁺大量外流，而胞内K⁺浓度下降被认为是激活经典NLRP3炎性小体的重要上游信号。

因此，非经典通路实际上通过“Caspase-11/4/5-GSDMD-K⁺外流”轴间接激活NLRP3炎性小体。随后NLRP3发生寡聚化并招募衔接蛋白ASC及Caspase-1形成经典炎性小体复合物，活化的Caspase-1进一步切割pro-IL-1β和pro-IL-18，产生具有生物学活性的IL-1β和IL-18并释放到胞外，从而放大炎症反应。此外，Caspase-1也可进一步裂解GSDMD，加强焦亡过程。

非经典NLRP3炎性小体在抵御细菌感染中具有重要保护作用，但其过度激活可导致严重炎症损伤。大量研究表明，该通路参与脓毒症、急性肝损伤、非酒精性脂肪性肝炎（MASH/NASH）、炎症性肠病及代谢综合征等疾病的发生发展。特别是在脓毒症和内毒素血症中，大量胞质LPS可激活Caspase-11/4/5，引发广泛焦亡和炎症因子释放，导致组织损伤和器官功能障碍。因此，靶向Caspase-4/5/11、GSDMD或NLRP3的药物干预已成为治疗炎症相关疾病的重要研究方向。

参考文献：

[1] Rathinam V, Fitzgerald K et al. Cell. 2016 May 5;165(4):792-800.

进化分析结果表明斑马鱼基因组中同样存在SAMHD1、NLRP3炎性小体组分及其他核苷酸代谢酶，说明该调控机制在脊椎动物中高度保守（图S4和数据S1）。研究人员利用CRISPR/Cas9系统敲除斑马鱼幼体中SAMHD1也导致斑马鱼体内NLRP3炎性小体激活增强（图2Y-Z）。

SAMHD1的核心生物学功能是催化脱氧核苷三磷酸水解分解，维持细胞核苷酸稳态。为验证SAMHD1抑制NLRP3过度活化是否依赖其脱氧核苷三磷酸水解酶活性，研究人员在Samhd1^⁻/⁻小鼠骨髓源性巨噬细胞中用过表达野生型人源SAMHD 1或两种dNTPase-失活SAMHD 1突变体的慢病毒来导入Samhd 1^+/+和Samhd 1^-/-BMDM，观察细胞炎症表型的恢复情况。结果显示，只有野生型SAMHD1能够抑制Samhd1^−/− BMDMs中的NLRP3炎性小体过度激活，减少ASC寡聚化和斑点形成、抑制Caspase-1激活、减少细胞焦亡与IL-1β分泌而水解活性酶失活突变体无任何修复作用（图S5A-G）。此外TNF的分泌水平不受这些SAMHD1构建体过表达的影响（图S5H）。这些结果表明，SAMHD1抑制NLRP3炎性小体过度活化的功能完全依赖其脱氧核苷三磷酸水解酶活性。

图S3：SAMHD1抑制NLRP3炎性小体的激活，但不抑制AIM2或NLRC4炎性小体的激活。

图S4：核苷酸代谢酶和NLRP3炎性小体组分在从鱼类到人类的进化过程中是保守的

图S5：dNTPase活性是SAMHD1限制NLRP3炎性小体过度激活所必需的。

6、SAMHD1在炎性小体预激过程中被激活

为探究在炎性小体预激和激活过程中SAMHD1是如何被调控的，研究人员检测了SAMHD1的表达水平和磷酸化修饰状态。结果显示在静息状态下小鼠的BMDMs可高表达SAMHD1，但LPS预刺激进一步上调了SAMHD1的蛋白表达（图S6A、图S6B）。通过使用特异性识别小鼠SAMHD1 T603位点（对应人SAMHD1的T592位点）的SAMHD1磷酸化抗体，研究人员还发现LPS预激显著降低了p-SAMHD1的水平（图S6A、图S6B）。同时促进SAMHD1四聚体组装（图S6A、图S6B）。这些结果表明，炎症预激活过程可显著激活SAMHD1蛋白功能。

SAMHD1的磷酸化修饰在细胞周期中受到严格调控，细胞周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinases,CDK2）通过磷酸化使SAMHD1失活，以确保在DNA合成前细胞内积累充足的dNTP，而CDK2的内源性抑制因子细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A(Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A,P21)能够抑制SAMHD1的磷酸化，从而维持其dNTP水解酶活性。此外，蛋白磷酸酶2A（Protein phosphatase 2A ,PP2A）可通过去磷酸化修饰激活SAMHD1的水解酶功能。研究人员发现，通过遗传或化学方法抑制p21或PP2A后。LPS诱导的SAMHD1去磷酸化效应被完全阻断（图S6C-G）。因此，研究人员得出结论：SAMHD1在炎性小体预激过程中被上调并被激活，这一过程依赖于p21和PP2A的共同调控。

为进一步验证SAMHD1磷酸化修饰对炎症功能的调控作用，研究人员在Samhd1^+/+和Samhd1^−/− BMDMs中分别回补野生型人源SAMHD1，、磷酸化模拟突变体T592D、去磷酸化模拟突变体T592V，其中磷酸模拟突变体T592D通过引入带负电荷的天冬氨酸破坏SAMHD1四聚体的稳定性，持续模拟磷酸化失活状态；而T592V将苏氨酸替换为缬氨酸，锁定去磷酸化状态，稳定SAMHD1四聚体结构功能。实验结果显示：回补T592V SAMHD1的Samhd1^−/− BMDMs中，由于抗体识别位点发生突变无法检测到SAMHD1磷酸化修饰，同时检测到SAMHD1四聚体形成增加，并伴随NLRP3炎性小体激活减弱（图S6H-J）。而回补T592D磷酸化失活突变体的Samhd1^−/− BMDMs，SAMHD1四聚体的形成受阻，且无法改善炎性小体过度激活表型（图S6H-J）。以上结果证实：SAMHD1介导的炎性小体表型依赖于其磷酸化修饰状态。