氢气改善抑郁样行为和认知障碍，通过抑制小鼠快速老化SAMP8模型的神经炎症

氢气改善了SAMP8小鼠的抑郁样行为和认知功能。

氢气减少了SAMP8小鼠大脑中的氧化应激。

氢气抑制了SAMP8小鼠的小胶质细胞活化和神经细胞凋亡。

氢气降低了SAMP8小鼠脑组织中IL-6的水平。

背景与目的

神经炎症是中枢神经系统的一种低度慢性炎症，与年龄相关的神经精神疾病如老年抑郁症和阿尔茨海默病有关。最近的研究探索了控制神经炎症作为一种新的治疗方法。氢气显示出抗炎效果。然而，其对神经炎症和与年龄相关的神经精神疾病的影响尚未明确。我们研究了氢气对小胶质细胞活化、神经炎症、抑郁样行为以及快速老化倾向小鼠模型SAMP8的短期认知衰退的影响。

方法

六周大的SAMP8或抗老化小鼠模型SAMR1从六周龄开始接受富含氢的水凝胶（HRJ）或安慰剂水凝胶（PJ）处理26-28周。使用尾部悬挂和强迫游泳测试评估抑郁样行为，而认知功能则通过Y迷宫和物体识别测试进行评估。大脑组织用于免疫组化研究或通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测量促炎性细胞因子水平。

结果

HRJ摄入减少了SAMP8小鼠在尾部悬挂和强迫游泳测试中的不动时间，并增强了视觉认知和空间工作记忆。此外，HRJ摄入抑制了SAMP8小鼠内侧前额叶皮层和海马齿状回中的8-羟基-2'-脱氧鸟苷（8-OHdG）、Iba1和裂解的半胱天冬酶3表达水平。进一步地，HRJ摄入显著降低了SAMP8小鼠脑组织中的IL-6水平。

结论

这些发现表明，氢气治疗可能通过调节活化的小胶质细胞诱导的神经炎症，改善SAMP8小鼠的抑郁样行为和短期认知障碍。

图表摘要

1. 前言

老年相关的小胶质细胞活化和神经炎症在老年抑郁症和阿尔茨海默病（AD）的进展中起着关键作用。激活的小胶质细胞产生促炎性细胞因子，导致神经损伤并损害神经生成。因此，抑制激活的小胶质细胞是治疗与年龄相关的神经精神疾病的一种策略。

氢气通过调节线粒体电子传递链发挥抗氧化作用，缓解线粒体损伤并中和氧化应激。此外，氢气通过影响炎症相关基因的转录发挥抗炎作用。几项动物研究表明，氢气通过抑制氧化应激来预防神经退行性疾病（如AD或帕金森病）的进展。然而，氢气对与年龄相关的神经精神疾病的影响尚未得到彻底研究。

快速老化小鼠（SAM），由AKR/J小鼠杂交而成，广泛分类为快速老化倾向小鼠（SAMP）或抗老化小鼠1（SAMR1），并通过衰老评分系统进行评估。根据其与年龄相关的病理特征，SAMP小鼠被分为几种类型。特别是，快速老化倾向小鼠8（SAMP8）小鼠更早地表现出与年龄相关的认知衰退和抑郁样行为，且衰老速度更快。由于SAMP8小鼠经历高氧化应激，与年龄相关的神经退行可能加速。此外，在年老的SAMP8小鼠的海绵状脑干病变周围发现了激活的小胶质细胞，但在年老的SAMR1小鼠中则没有发现。因此，SAMP8小鼠被认为是一种由神经炎症引起的与年龄相关的神经精神疾病的模型。

因此，我们进行了一项研究，检查了氢气对SAMP8小鼠中小胶质细胞活化、神经炎症、抑郁样行为和短期认知障碍的影响。

材料和方法

2.1 动物

四周大的雄性SAMP8（n = 20）和SAMR1（n = 10）小鼠在严格控制的环境中饲养，环境有规定的照明和温度，这些小鼠从日本SLC公司（静冈县，日本）获得。

2.2 富含氢的水凝胶和安慰剂水凝胶

富含氢的水凝胶（HRJ）和安慰剂水凝胶（PJ）均由新良株式会社（北九州，日本）提供。使用专利制造方法将氢气（40 mg/L）密封在HRJ内，而空气则以同样的方法密封在PJ内。

2.3 研究设计

所有小鼠在六周龄时开始每天给予10 g/天的HRJ或PJ代替水，持续26-28周。小鼠被分为三个实验组：接受PJ的SAMR1小鼠（SAMR1 PJ组）、接受PJ的SAMP8小鼠（SAMP8 PJ组）或接受HRJ的SAMP8小鼠（SAMP8 HRJ组）。行为实验在28至30周龄之间进行。所有小鼠从6到30周龄每两周称重一次。实验按照《研究中的动物：报告活体实验》（ARRIVE）指南和国家防卫医学院动物实验设施的道德准则进行（编号23042-1）。

2.4 行为实验

2.4.1 尾部悬挂测试

尾部悬挂测试采用既定方法评估抑郁样行为[13]。胶带固定在离尾尖5-10 mm处。将小鼠悬挂在距地面500 mm高的水平铁杆上，测量总不动时间（即头部向下指向或缺乏脚部运动）作为抑郁样行为的指标，持续时间为6分钟。

2.4.2 强迫游泳测试

强迫游泳测试遵循既定程序评估抑郁样行为[13]。在一个透明圆筒（直径25 cm，深度46 cm）中注入相当于三分之二体积的水（25 ± 1℃）。每只小鼠被放入圆筒中6分钟。小鼠无法逃离圆筒或用脚触底。不动是指保持头部露出水面所需的最小移动。总不动时间定义为抑郁样行为的指标。在小鼠之间更换圆筒中的水。

2.4.3 Y-迷宫测试

Y-迷宫测试采用之前描述的方法来评估短期空间工作记忆[14]。将小鼠放在Y型迷宫的固定臂上，让它们自由探索8分钟。记录进入各臂的顺序和总次数。正确交替的百分比计算为连续三次进入不同臂的次数除以（所有臂的总进入次数减去两次）× 100。这个测量指标是短期空间工作记忆的指示。

2.4.4 物体识别测试

物体识别测试遵循既定方法来评估短期视觉认知记忆。在第一阶段，小鼠遇到两个形状相同的物体，并使用一个20 cm × 30 cm的透明量规展示。让小鼠自由接触这些物体10分钟。在第一次会议后60分钟，用一个新物体替换其中一个物体。在第二阶段，让小鼠自由接触这些物体10分钟。识别指数定义为与新物体接触的百分比。这是短期视觉认知记忆的指标。

2.5 免疫荧光染色

行为研究结束后，每组5只小鼠被镇静。它们经过心脏灌注磷酸盐缓冲盐水（PBS）和4%多聚甲醛（Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan）。全脑在4%多聚甲醛（Wako Pure Chemical Industries）中固定24小时。冠状脑切片（1 mm厚）包埋在石蜡中。脑切片使用二甲苯脱蜡并在80%乙醇中再水化。使用的一抗包括兔抗8-OHdG（1:100; Bioss, Woburn, MA, USA），山羊抗Iba1（1:100; Wako, Osaka, Japan），小鼠抗NeuN（1:200; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）和兔抗裂解caspase-3（1:100; Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA）。使用的二抗包括Alexa Fluor 488偶联的抗小鼠IgG（1:200; Molecular Probes, Eugene, OR, USA），Alexa Fluor 488偶联的抗山羊IgG（1:200; Invitrogen, Waltham, MA, USA）和Alexa Fluor 546偶联的抗兔IgG（1:200; Invitrogen）。染色的切片在Vectashield Hardset Mounting Medium（Vector Laboratories, CA, USA）中用DAPI复染。使用Nikon C2共聚焦激光显微镜（Nikon, Tokyo, Japan）观察和记录免疫荧光。图像分析使用ImageJ软件（NIH, Bethesda, MD, USA）和NIS-Elements软件（Nikon）。

2.6 生化分析的组织准备

行为研究结束后，解剖每组5只小鼠的整个大脑。使用含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液从均质化的大脑组织中提取蛋白质（Nacalai Tesque, Kyoto, Japan）。均质化的样本在4℃下以10,000×g离心30分钟。离心后收集上清液并储存在-80℃。

2.7 大脑中的细胞因子水平

使用IL-1β酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（R and D Systems, Minneapolis, MN）、TNF-α ELISA试剂盒（R and D Systems）、IL-6 ELISA试剂盒（Biolegend, San Diego, CA）或IFN-γ ELISA试剂盒（Abcam）根据制造商的说明测量大脑中IL-1β、TNF-α、IL-6或IFN-γ的水平。

2.8 统计分析

数据以均值±标准误差（SEM）表示。所有数据通过Shapiro-Wilk检验确认符合正态性假设。统计分析使用单因素方差分析（ANOVA）或双因素重复测量ANOVA调整Geisser-Greenhouse的ε值，随后进行Tukey多重比较检验。统计显著性设定为p < 0.05。

3. 结果

3.1 氢气对SAMR1和SAMP8小鼠体重变化的影响

从6周到30周龄，SAMP8 PJ组和SAMP8 HRJ组的体重显著低于SAMR1 PJ组。然而，SAMP8 HRJ组和SAMP8 PJ组之间未观察到体重的显著差异（图1）。

图1. 氢气对SAMR1或SAMP8小鼠体重变化的影响。所有小鼠从6周龄到30周龄每两周称重一次。线性图表示SAMR1 PJ（n = 10）、SAMP8 PJ（n = 10）或SAMP8 HRJ（n = 10）组在6至30周龄期间的体重变化（图1）。数据以平均值±标准误表示。*p < 0.05, **p < 0.01（SAMR1 PJ组与SAMP8 PJ组对比），†p < 0.05, ††p < 0.05（SAMR1 PJ组与SAMP8 HRJ组对比）。

3.2. 氢气对SAMP8小鼠抑郁样行为的影响

通过尾悬挂试验（图2A）和强迫游泳试验（图2B）评估SAMP8和SAMR1小鼠的抑郁样行为。在尾悬挂试验中，给予安慰剂果冻（PJ）的SAMP8小鼠（SAMP8 PJ组）的总不动时间显著长于给予PJ的SAMR1小鼠（SAMR1 PJ组）。摄入富氢果冻（HRJ）显著减少了SAMP8小鼠的总不动时间（图2A）。在强迫游泳试验中，SAMP8 PJ组的总不动时间显著长于SAMR1 PJ组。HRJ摄入减少了SAMP8小鼠的总不动时间（图2B）。

图2. 氢气对SAMP8小鼠抑郁样行为的影响。进行尾悬挂试验（图2A）和强迫游泳试验（图2B），以评估SAMP8和SAMR1小鼠的抑郁样行为。柱状图表示SAMR1 PJ（n = 10）、SAMP8 PJ（尾悬挂试验中n = 10，强迫游泳试验中n = 9）或SAMP8 HRJ（n = 10）组的总不动时间的定量结果。数据以平均值±标准误表示。*p < 0.05, **p < 0.01。

3.3. 氢气对SAMP8小鼠视觉认知记忆和空间工作记忆的影响

通过物体识别试验（图3A）和Y迷宫试验（图3B）分别评估SAMP8和SAMR1小鼠的视觉认知记忆和空间工作记忆。在物体识别试验中，SAMP8 PJ组的识别指数显著低于SAMR1 PJ组。摄入富氢果冻（HRJ）显著提高了SAMP8小鼠的识别指数（图3A）。在Y迷宫试验中，SAMP8 PJ组的正确交替次数少于SAMR1 PJ组。HRJ摄入显著提高了SAMP8小鼠的正确交替次数（图3B）。

图3. 氢气对SAMP8小鼠视觉认知记忆和空间工作记忆的影响。通过物体识别试验（图3A）和Y迷宫试验（图3B），分别评估SAMP8和SAMR1小鼠的视觉认知记忆和空间工作记忆。柱状图表示SAMR1 PJ、SAMP8 PJ或SAMP8 HRJ组中识别指数和正确交替次数的定量结果。数据以平均值±标准误表示。每组n = 10。*p < 0.05, **p < 0.01。

3.4. 氢气对SAMP8小鼠8-OHdG和NeuN表达的影响

在内侧前额叶皮层和海马齿状回颗粒细胞中，大多数8-羟基-2’-脱氧鸟苷（8-OHdG）与神经元特异性标记物神经核抗原（NeuN）共定位（图4A, B）。在内侧前额叶皮层和海马齿状回颗粒细胞中，SAMP8 PJ组的8-OHdG表达水平显著高于SAMR1 PJ组。HRJ摄入显著抑制了SAMP8小鼠8-OHdG水平的增加（图4 A–D）。

图4. 氢气对SAMP8小鼠8-OHdG和NeuN表达的影响。免疫荧光图像显示内侧前额叶皮层（图4A）和海马齿状回颗粒细胞（图4B）中8-OHdG（红色）和NeuN（绿色）的染色情况，分别来自SAMR1 PJ、SAMP8 PJ或SAMP8 HRJ组。柱状图表示内侧前额叶皮层（图4C）和海马齿状回颗粒细胞（图4D）中8-OHdG阳性区域（%）的定量结果。白色标尺：50 μm。数据以平均值±标准误表示。每组n = 5。*p < 0.05, **p < 0.01。

3.5. 氢气对SAMP8小鼠Iba1表达的影响

在内侧前额叶皮层和海马齿状回中，SAMP8 PJ组的Iba1表达水平显著高于SAMR1 PJ组。HRJ摄入显著抑制了SAMP8小鼠Iba1表达水平的增加（图5 A–D）。

图5. 氢气对SAMP8小鼠Iba1表达的影响。免疫荧光图像显示内侧前额叶皮层（图5A）和海马齿状回（图5B）中Iba1（绿色）的染色情况，分别来自SAMR1 PJ、SAMP8 PJ或SAMP8 HRJ组。柱状图表示内侧前额叶皮层（图5C）和海马齿状回（图5D）中每0.1 mm²中Iba1阳性细胞数量的定量结果。白色标尺：50 μm。数据以平均值±标准误表示。每组n = 5。**p < 0.01。

3.6. 氢气对SAMP8小鼠裂解型caspase-3表达的影响

在内侧前额叶皮层和海马齿状回颗粒细胞中，大多数裂解型caspase-3与NeuN共定位（图6A, B）。在内侧前额叶皮层和海马齿状回颗粒细胞中，SAMP8 PJ组的裂解型caspase-3表达水平显著高于SAMR1 PJ组。HRJ摄入显著抑制了SAMP8小鼠裂解型caspase-3表达水平的增加（图6 A–D）。

图6. 氢气对SAMP8小鼠裂解型caspase-3和NeuN表达的影响。免疫荧光图像显示内侧前额叶皮层（图6A）和海马齿状回颗粒细胞（图6B）中裂解型caspase-3（红色）、NeuN（绿色）和DAPI（蓝色）的染色情况，分别来自SAMR1 PJ、SAMP8 PJ或SAMP8 HRJ组。柱状图表示内侧前额叶皮层（图6C）和海马齿状回颗粒细胞（图6D）中裂解型caspase-3阳性区域（%）的定量结果。白色标尺：50 μm。数据以平均值±标准误表示。每组n = 5。**p < 0.01。

3.7. 氢气对SAMP8小鼠大脑中IL-1β、TNF-α、IFN-γ和IL-6水平的影响

三组间大脑中的IL-1β或IFN-γ水平无显著差异（图7A和D）。SAMP8 PJ组大脑中的TNF-α水平显著高于SAMR1 PJ组，但HRJ摄入并未影响SAMP8小鼠大脑中TNF-α水平的增加（图7B）。SAMP8 PJ组大脑中的IL-6水平显著高于SAMR1 PJ组。HRJ摄入显著抑制了SAMP8小鼠大脑中IL-6水平的增加（图7C）。

图7. 氢气对SAMP8小鼠大脑中IL-1β（A）、TNF-α（B）、IL-6（C）和IFN-γ（D）水平的影响。柱状图显示SAMR1 PJ、SAMP8 PJ和SAMP8 HRJ组中促炎性细胞因子水平的定量分析。数据以平均值±标准误表示；每组n = 5。*P < 0.05, **P < 0.01。

4. 讨论

持续的小胶质细胞激活导致促炎性细胞因子的释放，引发促炎性级联反应，进而导致神经损伤和丧失。在阿尔茨海默病（AD）中，已观察到围绕淀粉样β斑块和老年神经元的小胶质细胞激活为促炎性的M1表型。

活化的小胶质细胞释放促炎性细胞因子，诱导神经损伤，损害神经发生，并导致大鼠出现抑郁样行为。我们观察到SAMP8小鼠内侧前额叶皮层和海马齿状回中的Iba1表达高于SAMR1小鼠。此外，SAMP8小鼠大脑中的IL-6和TNF-α水平也高于SAMR1小鼠。这些结果表明，SAMP8小鼠大脑中小胶质细胞激活和神经炎症被诱导。

活性氧物种（ROS）容易与氧分子相互作用，并对生物组分造成氧化损伤，主要来源于线粒体呼吸。随着年龄增长，脑中的线粒体DNA（mtDNA）突变积累，导致呼吸链功能失调。呼吸功能障碍增加了ROS的产生，这诱导了与年龄相关的认知障碍。此外，增加的细胞内ROS水平刺激小胶质细胞激活并诱导促炎性细胞因子的产生。

被羟基自由基攻击的DNA产生8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OHdG），其被用作敏感反映ROS对生物体影响的标记物。在AD模型小鼠中，8-OHdG和大脑中小胶质细胞激活的积累促进了AD病理生理学和认知衰退。我们的研究表明，内侧前额叶皮层和海马齿状回中氧化应激和小胶质细胞激活的积累与SAMP8小鼠的认知衰退和抑郁样行为有关。

氢气可以穿透细胞并中和细胞内OH和ONOO⁻，而对机体稳态影响甚微。此外，氢气防止了线粒体电子传递链的电子泄漏并改善了线粒体功能。氢气治疗抑制了大鼠脑缺血/再灌注后的小胶质细胞激活。在Aβ诱导的阿尔茨海默病大鼠模型中，氢气抑制了如IL-6、TNF-α或IL-1β等促炎性细胞因子的合成。它减少了大脑组织中c-Jun N-末端激酶（JNK）和核因子κB（NF-κB）通路的活性。

在4至8周龄的SAMP8小鼠大脑中观察到多个mtDNA缺失和电子传递紊乱，可能导致自由基产生和氧化应激。在1-2个月龄的SAMP8小鼠脑干中观察到反应性小胶质细胞簇。在SAMP8小鼠的皮质和海马中也观察到小胶质细胞激活。本研究结果表明，氢气处理抑制了内侧前额叶皮层和海马齿状回颗粒细胞中小胶质细胞的激活并减少了氧化应激的积累。

在本研究中，氢气降低了SAMP8小鼠大脑组织中的IL-6水平。Kong等人（2015年）证明，IL-6直接调节5-羟色胺转运蛋白水平，并影响小鼠海马神经元和表达5-羟色胺转运蛋白的人绒毛膜癌细胞中的5-羟色胺摄取。该研究还表明，IL-6通过转录3激活因子（STAT3）信号通路调节5-羟色胺能神经传递，导致小鼠出现抑郁样行为。Monje等人（2003年）显示，添加中和抗IL-6抗体可恢复暴露于激活的小胶质细胞的条件培养基后的受损体外神经发生。因此，IL-6直接抑制神经发生。在SAMP8小鼠中，抑制小胶质细胞激活降低了大脑中的IL-6水平并改善了异常行为。IL-6可能在与年龄相关的神经精神障碍进展过程中受损的神经传递、神经发生和异常行为中发挥关键作用。

含有氢气的水施用具有抗氧化作用，并防止老年SAMP8小鼠的认知障碍。我们的调查揭示，氢气治疗改善了老年SAMP8小鼠的抑郁样行为、视觉认知记忆和空间工作记忆。此外，氢气治疗抑制了老年SAMP8小鼠大脑中的氧化应激、小胶质细胞激活、IL-6水平和神经凋亡。

据报道，SAMP8小鼠的体重显著低于SAMR1小鼠。在本研究中，从6到30周龄，SAMP8小鼠的体重也显著低于SAMR1小鼠。在SAMP8小鼠中未观察到HRJ和PJ给药之间的显著体重差异。结果表明，HRJ对SAMP8小鼠的发育无害。然而，也应考虑SAMR1和SAMP8小鼠之间的体重差异是否影响了行为实验的结果。

5. 结论

氢气处理通过抑制内侧前额叶皮层和海马齿状回中的氧化应激、小胶质细胞激活和神经凋亡，显著改善了SAMP8小鼠的抑郁样行为和短期认知障碍。此外，该处理显著降低了SAMP8小鼠大脑中的IL-6水平。这些发现表明，氢气可能通过减轻神经炎症来改善与年龄相关的神经精神障碍。