一、产品简介：

当生物体遭受外界胁迫时，生物体内超氧阴离子等活性氧大量产生和积累，可作为生物体氧化胁迫的信号。因此在逆境条件下生物体内超氧阴离子自由基的产生，可间接反映组织细胞受损状况和抗性强弱。

超氧阴离子与羟胺反应生成NO₂^－，NO₂^－在对氨基苯磺酸和α-萘胺的作用下，生成粉红色的偶氮染料，该染料在530nm处有最大光吸收，根据A530值可计算出样品中的O₂^－的含量。

二、试剂盒组分与配制：

三、需自备的仪器和用品：

酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。

四、操作步骤：

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、预实验样本制备

① 组织样本：称取0.1g样本，加入1mL提取液进行冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取。

② 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。

2、标准溶液的配制：把10μmol/mL标准品母液用蒸馏水稀释成0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125μmol/mL的标准溶液备用。

3、预实验上机操作：

① 酶标仪预热30min以上，调节波长至530nm。

② 操作表：

4、正式实验：

① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围：高于最高值建议将待测样本用蒸馏水适当稀释后再进行测定，低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定，并将改变后的D和W代入公式计算；

② 确定好最适实验条件后，正式实验样本制备同预实验样本制备；

③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行（标准管和空白管预实验已做，正式实验可选做）。

五、结果计算：

1、以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA测定带入方程得到x（μmol/mL）。

2、按照样本质量计算：

超氧阴离子含量(μmol/g 质量)=x×V1÷(V1÷V×W)×2×D=2×x÷W×D

3、按照液体体积计算：

超氧阴离子含量(μmol/mL)=x×2×D

V：加入提取液体积，1mL；             V1：反应中样本体积，0.025mL；

W：样品质量，g。                      D：稀释倍数，未稀释即为1；

2：2分子O₂^－参与反应生成1分子NO₂^－。

注意事项：

样本制备好后，立刻进行测定，请勿将样本进行长时间的低温保存，以免影响测定结果。