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一、产品简介:
超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基,可攻击生物大分子,引 起细胞结构和功能的破坏,与机体衰老和病变有很密切的关系,清除超氧阴离子自由基 的研究已经得到了广泛的关注。
在弱碱性条件下,邻苯三酚能发生自氧化反应产生超氧阴离子和有色中间产物,该中间产物在320nm处有特征吸收峰。当加入超氧阴离子清除剂时,它能迅速与超氧阴离子反应从而阻止中间产物的积累,使溶液在320nm处光吸收减弱。故可以通过测定A320nm值来评价清除剂对超氧阴离子的清除能力。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体50mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体12mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂×1支 | 4℃避光保存 | 临用前甩几下,使粉剂落到底部,加入1mL蒸馏水,充分溶解。 |
试剂三 | 液体2mL×1支 | 4℃保存 |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板(UV板)、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取0.1g样本,加入1mL提取液进行冰浴匀浆,12000rpm,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。
2、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至320nm。
② 试剂一和二需于室温(25℃)预热20min。
③ 操作表:
试剂名称(µL) | 测定管 | 对照管 | 空白管 |
试剂一 | 200 | 200 | 200 |
室温(25℃)孵育 10min | |||
样本 | 10 | 10 | - |
蒸馏水 | - | 20 | 10 |
试剂二 | 20 | - | 20 |
室温(25℃)孵育 5min | |||
试剂三 | 10 | 10 | 10 |
混匀后,室温,准确反应3min,于320nm处读取吸光值A,分别记为A测定、A对照、A空白。(注:空白管只需测定1-2次) |
4、正式实验:
① 若 A 测定减 A 对照的差值大于空白管,需增加样本加样量(如由10μL 增至 30μL,则试剂一相应减少);若 A 测定减A 对照的差值小于 0.1,需对样本适当稀释后再检测;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
超氧阴离子清除率 I%=[1-(A测定-A对照)÷A空白]×100%
注意事项:
不同样本清除能力不一,可先选取2个样本做预实验检测。
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GMT+8, 2024-8-16 18:51
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