新型分子克隆技术──Nimble Cloning (NC克隆）

Nimble Cloning简介

Nimble Cloning（NC克隆）能将线性DNA或环状质粒（入门克隆）上的DNA通过Nimble Mix直接克隆到NC系统的环状表达载体，无需表达载体的线性化处理，其形式类似于Gateway克隆。

NC克隆的3个优点：1. 使用灵活。既可使用PCR产物，又可使用入门克隆；既可使用通用接头进行标准化克隆，又可灵活设计接头进行无缝克隆（不想要的序列在克隆反应中消除，真正的无缝克隆！）。2. 操作简单，克隆效率高。无需载体的酶切、回收步骤，省时省力的同时提高克隆效率和克隆成功率。3. 标准化。加通用接头的DNA可克隆到NC系统所有载体，为标准化克隆系统。 

操作步骤

1．引物设计

   目标基因需通过引物在两端加带20bp的通用接头序列，或加带20bp的通用接头序列侧翼的重叠序列（此为去除通用接头的NC无缝克隆）。加通用接头的目标基因可克隆到NC系统的所有载体。

A.    加通用接头序列的引物设计：

   上游引物：5'-agtggtctctgtccagtcct-基因上游特异序列-3'

                通用接头1

   下游引物：5'-ggtctcagcagaccacaagt-基因下游特异序列-3'

                 通用接头2 

B.     NC无缝克隆的引物设计：

选取NC系统表达载体上通用接头序列侧翼（100bp内）的20bp序列。以NC系统原核表达载体pNC-ET28为例（图1），如需进行去除通用接头序列的无缝克隆，则在通用接头外侧100bp范围内可任意选择20bp序列作为引物的接头序列（但需考虑阅读框，避免移码），目标基因将被克隆到被选择的两个20bp序列之间。如图1所示，如果选择2个下划线的20bp序列作为目标基因的接头序列，则通过NC克隆反应后目标基因将克隆到2个下划线序列之间（通用接头序列将在反应中消除），该对引物的设计为：

上游引物：5'-gcctggtgccgcgcggcagc-基因上游特异序列-3'

   下游引物：5'-tgctcgagtgcggccgcaag-基因下游特异序列-3'

   （注意：该对引物只针对pNC-ET28，不同pNC载体的无缝克隆引物不同）                             

图1  pNC-ET28的Nimble Cloning无缝克隆的引物设计示例

 2．PCR扩增目标基因

   利用上述设计的引物进行PCR扩增目标基因（使用高保真酶），建议使用含目标基因的质粒为PCR模板，25-30个循环，超过30个循环可能导致复杂结构的PCR产物，严重影响克隆效率。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收后可直接用于下一步的NC克隆反应，也可利用本公司的入门克隆构建试剂盒构建入门克隆，利用入门克隆进行NC克隆反应。 

3．Nimble Cloning反应

   将步骤2获得的PCR产物或入门克隆与NC系统的表达载体混合（片段、载体和灭菌水共5 ul），加入5 ul Nimble Mix，用移液枪吸打10-20次，充分混匀，50℃（去除接头序列的无缝克隆推荐使用37℃）反应30-60 min后，将2-5 ul反应产物转化50 ul常规感受态细胞（如DH 5a、Top 10）。转化平板37℃过夜培养后挑选克隆进行PCR鉴定，阳性克隆进行测序验证。克隆反应体系和相关说明见表1和表2。 

4．阳性对照反应（可选步骤）

Nimble Positive Control中含有NC系统表达载体和LacZ基因，LacZ基因克隆到表达载体后进行蓝白斑显色。取5 ul Nimble Positive Control和5 ul Nimble Mix混合，50℃反应1小时后，将2-5 ul反应产物进行转化，涂布Amp+IPTG+Xgal平板，37℃过夜培养后蓝色菌落为阳性克隆。

 注意事项

    如目标基因中含有限制性内切酶SfiI位点，需将表达载体先用SfiI酶切，回收后的载体与目标基因混合，利用本公司表达载体改造试剂盒中的Pre-Nimble Mix进行克隆反应。

Nimble Cloning试剂盒使用说明书.pdf