1. NC克隆系统与目前很多公司销售的一步克隆试剂盒相比有什么优点？

NC克隆与目前很多国内公司销售的一步克隆（或称快速克隆、无缝克隆）试剂盒以及国外公司的Gibson、In-Fusion试剂盒在克隆原理上相似，都是基于重叠DNA序列（20bp左右）介导的同源拼接。

与它们相比，NC克隆的区别和优点有3个方面：1. 简单。载体直接用于克隆反应，不需要酶切回收，真正的一步克隆！不仅省时省力（省去载体酶切和回收步骤）、省经费（无需购置一系列内切酶），还提高了克隆效率和克隆成功率（减少了操作步骤，降低了操作失败的风险， 比如酶切不充分、 酶切回收浓度低等问题）。2. 标准化。所有系统载体带有相同的通用接头序列，一个基因只需一对引物就可以克隆到系统所有载体。3. 灵活。既可使用通用接头进行标准化克隆，也可将接头设计在通用接头外围进行无缝克隆，克隆位点处不想要的序列在克隆反应中消除，真正的无缝克隆！

2. NC克隆最多能几个片段一起克隆？最多能克隆多长的片段？

    NC克隆的原理与Gibson等同源序列克隆方法相似，均能进行多片段和长片段克隆。我们对同时克隆3个片段（35S启动子、GFP和Nos终止子）的研究发现，NC克隆的效率要高于Gibson。但目前对任何克隆技术而言，都是片段数越多、片段越长，克隆难度越大。至于最多能克隆多长的片段，Gibson的发明是用于基因组组装的（数百kb），因此限制因素不是克隆技术，而是载体和菌株的稳定性。对于常规的表达载体而言，一般认为大于20kb会比较难在大肠杆菌中克隆。NC克隆的优点（简单、标准化和灵活）主要体现在常规克隆（1-3个片段、长度几kb内）。目前我们尚未对NC克隆技术能克隆的片段长度和片段数的上限进行研究。

3. NC系统载体怎么选择？

NC载体主要由现有常用的载体改造而来，同类载体有多种是为了大家都能找到自己需要或熟悉的载体。比如植物过表达载体的区别主要是载体框架不一样，有pCambia、pGreen、pBI121等常用的植物双元表达载体框架，有些实验室习惯pCambia，有些实验室觉得pGreen好用，而有些实验室觉得pBI121表达效果好。另外有些系列的植物载体也包括不同的植物筛选基因（潮霉素、卡那和除草剂），根据植物材料的要求或实验室建立的转化体系选择。

植物荧光蛋白标签载体和植物BiFC载体都有荧光蛋白在NC克隆框（目标基因插入位置）的N端或C端2种载体供选择，是因为荧光蛋白与目标基因融合表达可能会影响目标基因的表达或功能，而不同端融合表达产生的影响可能不一样。因此，如果用N端载体得不到满意的结果，可换C端载体试一下，反之亦然，或两种载体同时做。

4. NC系统载体好用吗？

如上所述，NC载体主要由现有常用的载体改造而来，在现有载体的克隆位点处加入NC克隆框，只是克隆位点处有改变，其他未变。对于载体是否好用可以从两方面回答：1：克隆方面是否好用？这点是肯定的。第一个问题已经回答了NC克隆系统的优点。2：表达方面是否好用？目标基因克隆到NC载体后会取代NC克隆框，因此载体序列与原始载体一致，除了留下21bp的通用接头序列（疤痕序列）。我们的研究表明21bp的通用接头序列不影响目标基因的表达（包括原核表达和植物表达）。但目前我们只比较了少数几个基因的表达。当前几乎所有载体，包括酶切-连接系统的载体和Gateway系统的载体，在克隆后都会留下疤痕序列（一到数个酶切位点序列、25bp attB序列），不少实验室认为attB序列会影响目标基因的表达。NC系统的通用接头序列经过优化设计，设计过程考虑各碱基的平均分布，以及避免出现发夹结构、起始密码子等序列，理论上要优于酶切位点序列和 attB序列。并且，如果不想要任何疤痕序列，NC克隆可以进行无缝克隆，只需将接头设计在通用接头外围，通用接头即可在克隆反应中消除。

5. 什么时候使用通用接头做标准化克隆？什么时候做去除通用接头的无缝克隆？

如问题4所述，NC系统的通用接头序列经过优化设计，设计过程考虑各碱基的平均分布，以及避免出现发夹结构、起始密码子等序列，理论上要优于酶切-连接系统和Gateway系统留下的酶切位点序列和 attB序列。并且我们的研究也表明通用接头序列不影响目标基因的表达，包括原核表达和植物表达，相关结果已发表在NC克隆的文章（Yan et al., 2020）。因此常规情况下我们推荐使用通用接头做标准化克隆。某些特殊的情况下，只想表达基因自身的序列，比如原核表达中，如果蛋白纯化后的His标签都需要切掉，这种情况做去除通用接头的无缝克隆比较好。

6. 为什么NC克隆中会出现载体自连？

目前基于同源序列拼接的克隆技术都会存在错连的现象，原因是虽然目标基因与载体的两端有20bp左右的同源序列，但其他部位也可能存在同源序列，从而产生错连。一般情况下错连率比较低，但如果目标基因具有复杂结构，设计的20bp同源序列不能相遇和结合，其它短的同源序列，包括载体自身几bp的同源序列也会产生连接。在没有其它更长的同源序列竞争的情况下，载体自连的比例会比较高。以质粒为模板扩增、减少扩增循环数能减少PCR产物形成复杂结构，从而提高克隆阳性率。我们也正在研究其他更有效的方法以减少载体自连。

7. 要不要使用NC克隆的入门载体？

NC克隆使用灵活的一个体现之处是既可使用PCR产物（加20bp接头），也可使用入门克隆。如果目标基因已经克隆到T载体或表达载体，则利用加接头的引物扩增，直接使用回收的PCR产物用于克隆反应更方便。如果是目标基因尚未克隆，尤其是对于缺少基因组参考的扩增难度较大的目标基因，使用加接头的引物可能会进一步增加扩增难度，这种情况可以用基因自身引物扩增，产物加A后利用TA克隆连接到入门载体。

8. 为什么取名叫Nimble Cloning？

Nimble Cloning，简称NC（你行）克隆。Nimble为灵活之意，这也是NC克隆的一个主要特点，使用灵活。与Gateway克隆相比，NC克隆的使用灵活之处有：1. NC克隆既可直接使用PCR产物，也可使用入门克隆；2. NC克隆既可使用通用接头进行标准化克隆，也可进行无缝克隆（通用接头可在克隆反应中消除）；3. NC克隆可方便地进行多片段克隆。