目前实验室常用的远场单分子荧光显微镜主要为共聚焦显微镜和宽场显微镜。

图2.3.1 样品扫描共聚焦显微镜示意图

如示意图2.3.1所示，共聚焦显微镜是指将激发光聚焦的染料分子上，同时染料分子发射的荧光通过同一物镜收集后聚焦到探测器上进行检测。但是在此显微镜下只能激发和检测样品的一个点，因此如果想得到样品的成像，必须对样品的不同位置进行扫描，扫描的方式一般有这两种：样品扫描和激发光扫描。样品扫描是通过压电装置非常精细的移动样品，从而实现对整个样品的检测。样品扫描需要非常稳定的扫描平台，一般价格昂贵，但是扫描面积大，对光路调节要求较低，一般商用共聚焦显微镜选用样品扫描；而激发光扫描则是通过改变激发光的角度，从而使激发光聚焦在样品的不同位置，实现样品成像。这种方法相对比较便宜。而且激光扫描不需要移动样品，对于一些特殊条件下不易移动的样品，必须使用激光扫描。当然对于激发光扫描的共聚焦显微镜，一个很重要的问题是，当改变激发光的角度时，激发光很容易偏离原来的光路，从而照射到透镜以外的地方而无法激发样品。而且即使激发光改变很小的角度，通过透镜聚焦到样品上的光强也会发生变化，从而造成成像的偏差。因此必须在物镜与二维扫描镜之间使用望远镜系统。如图2.3.2所示，经过此望远镜系统后，即使扫描镜将激发光改变较大角度后，激发光让然可以在透过望远镜系统之后照射到物镜上，从而实现只改变角度而不改变入射位置的要求。无论哪种扫描方式，共聚焦成像需要一个点一个点进行对样品进行观测，所以成像速度较慢。但是由于衍射极限的限制，一般聚焦光斑为几百纳米，这样仅仅光斑下的分子可以被激发，其它位置的分子可以避免受到光照而变性。

图2.3.2激光扫描共聚焦显微镜示意图

目前常用的共聚焦显微镜往往不将物镜收集的荧光直接聚焦的探测器上进行检测，而是增加另外一个装置：针孔。如图2.3.3所示，物镜收集染料荧光后，通过透镜聚焦在针孔上，透过针孔后的荧光进行第二次聚焦才被检测器检测。在图2.3.3中，绿色荧光表示在物镜聚焦点上的目标染料所发射荧光，经过物镜收集后透镜聚焦在针孔上，并穿过针孔达到检测器；而红色代表不在物镜焦点上的染料分子所发的荧光，同样可以被物镜收集，并通过透镜聚焦，由于其聚焦位置不同，如果图所示，绝大部分光将被针孔装置拦截而不能到达探测器。因此针孔的添加不仅可以大大减小杂散荧光的干扰，还可以共聚焦显微镜在光传播方向上具有更好的分辨率，使其可以进行样品的三维成像。而且共聚焦成像更方便同时探测光谱和寿命等其它的荧光属性。

图2.3.3 具有针孔装置的共聚焦显微镜示意图。绿色代表在物镜聚焦点上的染料分子所发射的荧光；红色代表不在物镜焦点上的染料分子所发射的荧光。

宽场荧光显微镜是指激发光在样品上平面上并不聚焦成衍射极限的光斑而是较大面积，因此宽场激发的激发光可以使用普通光源而并非必须是激光，但是由于激光较好的准直性和光谱纯度，单分子荧光光谱研究中仍使用激光作为激发光源。为了实现对样品的宽场激发，通常在激发光路上物镜前加一个长焦透镜，使激光聚焦在样品平面之前或之后，从而在样品平面上得到较大的激发面积。由于宽场荧光显微镜不止激发一个单分子，因此其探测不能使用雪崩二极管或光电倍增管等，必须使用探测器阵列即CCD。

图2.3.4 宽场显微镜原理示意图

通过宽场显微镜可以实时观察到样品的形状以及运动，对于单分子光谱研究来说，宽场显微镜可以同时对多个分子进行成像，并且可以实时研究分子的变化和运动。但是由于CCD数据读取速度相对较慢，因此对于快速动力学研究，宽场显微镜并不适合。宽场显微镜可以大大提高单分子光谱的统计研究的效率。但是由于需要同时激发多个分子，一般需要将激光进行散光处理，即激光不能聚焦在样品上，由于激光光斑能量分布的不均匀造成每个分子上的激发光能量不同对性质研究造成一定的误差。同时由于能够同时对多个分子进行探测，因此不能直接进行其它荧光属性的研究比如光谱和寿命等。由于激光并不是聚焦在分子平面上，因此沿光的传播方向上整个样品都将受到光的照射下，背景杂散光以及杂质的影响比较大，因此对样品的纯度以及基片的干净程度要求较高。

全反射荧光显微镜 全反射荧光显微镜是为了大大降低激发光干扰的一种显微镜，如果图2.3.5右图所示，激发光通过棱镜，在另一个镜面上发生全反射。由于物镜在该镜面下方，几乎没有激发光被收集，因此大大降低了由于激发光造成的背景光。而附着在该镜面上的染料分子会受到激发光的照射被激发到激发态，从而产生荧光发射。荧光可以通过物镜收集后被探测器检测。这种全反射荧光显微镜具有非常低的激发光干扰，但是由于染料分子的荧光发射并非在三维空间上均匀分布，研究表明，在不同折射率材料界面上的荧光发射，大部分荧光发射将倾向于高折射率的介质，因此荧光收集效率很低。

图2.3.5 全反射荧光显微镜原理示意图

另外一种全反射荧光显微镜如图2.3.5左图所示，激发光和荧光收集通过同一物镜实现。激发光从物镜的边缘透过物镜并聚焦在样品上，在物镜数值孔径足够大的情况下，激发光与样品平面可以呈较大角度，从而实现全反射。反射的激发光则通过物镜的另一边缘沿原光路返回。样品荧光则通过同一物镜进行收集，只要在透镜后将发射激发光挡住即可。这种全反射荧光显微镜不仅降低了激发光的干扰，同时对荧光收集效率影响较小，因此是实验室较为常用的方式。但是为了实现激发光的全反射，对物镜的数值孔径要求较高，理论上讲数值孔径的增大有利于荧光收集以及提高分辨率，但是对于一些需要研究荧光偏振性质的研究可能会造成影响，因为在较大入射角度的情况下，激发光的偏振已经不仅仅局限在样品平面，而且所发射荧光的偏振也将受到影响。