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波谱学基础 精选

已有 14389 次阅读 2013-6-14 10:47 |个人分类:评论|系统分类:科研笔记| 波谱学基础

  最近正组织一些人出版一部单分子生物物理专著,下面是第二章关于波谱学的一节。有感兴趣的朋友欢迎加入我们参与写作。

  波谱最早指可见光通过棱角时不同波长光的发散,然而现的波谱学概念早已得到了极大的延伸。波谱学主要研究具有特定波长或频率的电磁波与物质的相互作用,波谱学数据就是吸收或发射强度随波长的变化规律。具体来说就是物质在特定波长的吸收或发射的强弱,这种吸收或发射的信号强度往往于产生这种吸收和发射的物质浓度相关。比如蛋白质在280纳米波长有特定吸收,因为蛋白中的芳香组氨基酸在280纳米有强吸收,蛋白的浓度高,吸收就高,所以我们可以通过280纳米波长电磁波的吸收值来反推蛋白质的浓度。如果蛋白中没有芳香组氨基酸,不管蛋白浓度多高,吸收也很弱。因此对没有芳香组氨基酸的蛋白我们就要用其他的办法来测量蛋白浓度,比如Biorad公司生产的一种蛋白燃料可以非特异结合到蛋白质上,我们可以用燃料染色我们的蛋白,没有结合蛋白的燃料是没有光吸收的,这样我们就可以根据染料的特定吸收来推测蛋白浓度。首先我们用浓度已知的蛋白如BSA等做一个标准的吸收浓度曲线。比如我们买商品化1g包装的BSA,配制成1g/ml的母液,然后稀释成100mg/ml, 10mg/ml,1mg/ml,100μg/ml,10μg/ml等梯度BSA溶液,对每个浓度的BSA溶液测量Biorad染色后在595nm的吸收,把BSA浓度与595nm吸收值化成一个标准的吸收直线,然后测量浓度未知蛋白溶液的595nm吸收,通过标准吸收直线的比对找到未知的蛋白浓度。

   在实际的实验操作中,我们可以通过检查产物或反应物的波谱学变化,推测相应的物质浓度变化,进而推测化学反应或酶催化反应的分子机制。如果产物和反应物都没有特异的波谱学特征,我们可以加一步化学反应,将反应物或产物生成有特定吸收的物质,这在化学或酶动力学研究中非常常见。举一个在细胞成像中常见的例子,我们经常通过辣根过氧化酶来进行免疫显色,原因就是抗体的波谱学特征与一般蛋白并不差异,但辣根过氧化酶有独特的波谱学吸收,因此辣根过氧化酶标记的抗体可以更准确的对抗体进行定量。

电磁波谱的波长跨越10几个数量级,从高能γ射线到低能的微波和无线电波。物质与不同波长或能量的电磁波相互作用后会发生怎样的结构或状态变化呢?理解这一问题就是理解红外,可见,紫外,微波,核磁等波谱的物理学基础。因为本章作为后续章节的铺垫性环节,笔者力求内容的相关性,在此我们并没有奢求囊括波谱学的方方面面。我们希望读者能对波谱学有一个基本的概念和理解,知道不同波谱技术的区别,为什么物质只在那个特定的波长吸收。比如讲蛋白的吸收是280nm,为什么吸收值不是280.5nm?所谓的单分子波谱技术无非就是因为波谱技术分辨率的提高,我们可以研究一个分子的波谱学特征,传统的波谱技术研究的是一群分子的平均特征。说到波谱与显微镜的区别,笔者认为显微镜就是定点波谱学,波谱学探测的是溶液或任何系统中所有分子吸收和释放的特定电磁波总和,显微镜同样要测量吸收或放射电磁波强度,但显微镜告诉我们是样品中哪个点,哪个部分产生了这么多的吸收和放射,比如DAPI染色的荧光成像,显微镜无非就是告诉我们细胞哪个部分如细胞核放出了荧光信号,那些地方没有荧光信号,所以笔者认为显微镜就是定点波谱学。虽然这一说法有离经叛道,但不失为一种认识显微镜的新角度。



图1: 电磁波谱。电磁波谱因能量或频率的不同分成几个区段,如gamma射线,X射线,紫外,可见光,红外,微波,无线电波。光子的能量除了可以用频率表示外,也可以用波长表示,频率高能量就高,波长短能量就高。不同区段波长的大小相当于不同物体尺寸的大小,如蜜蜂就是红外线波长的大小,针孔就是可见光波长的大小,原生动物就是紫外线的波长大小,原子是X射线波长的大小等。最后一排是频率的大小,而标记在区段名称下面的是波长的大小,二者互为相反。

   波普学的理论基础是量子力学,为免于掉到量子力学繁琐的数学计算中,我们力求只表达量子力学的基本概念。量子化是我们从宏观世界进入微观世界需要时刻谨记的认知原理。所谓量子化就是物理量的不连续性。举一个类比,在统计学中,我们通常把数据分为连续数据(continuous data)和分类数据(categorical data),量子力学就像是分类数据,我们只能取0,1,2之类的整数去描述量子态,但我们不能用连续数如3.22等描述。为什么微观世界的运动要量子?这是个有趣的问题,但不在本书的讨论范围内,当然我们也不知道答案。既然说到量子化,那什么东西量子化,是原子分子质量量子化吗,显然不是。量子化是指微观粒子运动状态量子化。那微观粒子都有什么运动状态呢?首先我们先回忆一下高中物理中讲的原子结构,原子有原子核和核外带负电并绕核转动的电子。原子核与电子之间是没有其它粒子存在的,而这个没有粒子存在的空间占据着原子绝大数的体积,如果我们将一个大楼的所有原子的电子压缩到原子核上,那大楼的大小比一个芝麻粒还小,由此可以想象原子核与电子间这个空间的大小。这个被压缩的芝麻粒密度相当,这也是黑洞能吸收光的原因。原子有原子核和核外电子,那原子的运动就包括原子核的运动,电子的运动,原子核和电子组合的整体运动。电子在原子核外特定的轨道上随机运动,每个特定的轨道对应着相应的能量级,因此如果我们人为的改变电子的运动轨道,我们就要输入能量或获得能量。比如我们对蛋白质进行280nm波长电磁波的照射,电磁波就是具有特定能量的光子流组成的具有波粒二相性的“物质”,电磁波的光子被蛋白质上特定原子上的核外电子吸收,吸收了能量的电子就不满足在低能级轨道上运动而跑到高能轨道,因此电子被激活到高能级,这就是所谓的激发态。这里涉及了另一问题,为什么蛋白质中只有特定原子才吸收280nm波长光子,其他的原子也都被照射了,为什么他们不吸收?这也是微观世界的一个普遍规律,我们必须理解为什么吸收只在特定原子或电子上进行。

   要理解这一问题,我们就要认真讨论一下共振的概念。在高中物理的物质波部分,我们曾简单提到了共振的概念。请原谅我经常在此回忆高中物理的内容,因为我真正的物理学背景就是高中物理,我的本科专业是生物技术,后来在美国拿到了一个物理化学的硕士学位,但我从来没有真正的物理背景。中国有句成语叫物以类聚,人以群分。大概意思就是相同的事物总是聚集在一起,志趣相投的人总希望聚在一起。我们自己在交朋友的过程也喜欢结交与自己兴趣爱好相同的人,这叫“共”鸣,所谓共就是一致。为什么志趣相投的人愿意聚在一起,从感性的角度上很容易理解。但巧合的是无生的物质世界也遵从同样的规律,物以类聚。在量子世界里物以类聚的道理同样适用,能量相同的电子要在一个轨道运动,如果有的电子能量高于轨道的其它电子,那它就不合群了,要跑到跟他和群的即具有类似电子能量的其它轨道上去。电子低轨道的能量与高轨道的能量差是ħυ,如果电子要从低能轨道越迁到高能轨道就需要ħυ这么大能量,因此你如果想把一个电子从低能级推到高能级,你就要输入ħυ大小的能量,你给多了或输入能量多了我不稀罕,你给少了余额不足。只有当外源电子携带的能量正好是ħυ,电子才会吸收这个光子跃迁到高能级状态,其它情况一概不接受,这也是比较死板的规律。很多人总是在这里无法理解,为什么它就吸收那么多,就像我付款付多了,多出的当小费不行吗,答案在微观世界就是不行。当光子的能量与电子越迁的能量一样时,光子被吸收,两个能量一样的东西(跃迁需要的能量和单个光子的能量)聚在一起了,因此叫共振。因为粒子就是波,就是振动,所以共振就是共同的振动频率,共同的能量。有了共振的概念,我们就可以理解为什么蛋白中只有部分原子能吸收280nm的波,因为这些原子的电子在从低能到高能级越迁时就需要这些能量,一句俗语概括就是王八瞅绿豆对眼了。

   前面提到了量子世界的运动有电子和原子核的运动,我们在介绍共振时着重介绍了电子的迁运动。只有当电子迁时,能量才是量子化,而电子在核外轨道运动时程随机分布的电子云,电子的在轨运动没有量子化,因此就没有量子化的吸收,就没有特定电磁波的吸收。电子的能量吸收只有在跃迁时才有,也可以说电子的量子运动只有这一种运动。那原子或分子有什么特异的运动吗?分子有振动(两个原子间的化学键像一个弹簧一样连着两个球形的原子,振动就是两个原子间的距离不断的增大缩小所伴随着的运动),有平移运动,有转动,但分子没有越迁,因为电子的轨道是原子核(电子受原子核限制在特定轨道运动)产生,而分子没有限制(溶液中的分子是布朗式的随机运动)它的类似“原子核”的东西。分子振动所需要的能量略高于分子的转动,但二者之间是有交叉的。所谓交叉就是说一些小原子或分子的振动能量可能与大一些的原子或分子的转动能量相当。所以在研究分子混合物时,我们有可能同时探测了分子的振动和转动。原子或分子的振动与转动所需要的能量相比于电子越迁要小的多,因此改变分子的运动状态所输入的能量也就相对小,入射激发光的波长也不需要那么短,频率也不用那么高。因为光子的能量只与波长相关,所以电子越迁需要波长较短的红外或可见光,而原子或分子的振动或转动就只需要能量较低波长较长的红外光。因此红外和可见光谱是研究电子能级越迁的技术,而红外光谱是研究原子或分子振动或转动的技术。

在讲到红外光谱时,我们在此顺带提及一下拉曼光谱,拉曼光谱可以看成是一个电子越迁与分子振动同时发生的过程(一个光子要做两件事:改变电子轨道,改变分子运动状态),因此拉曼光谱需要的光子能量更高,波长比红外波谱要短。拉曼过程中电子要释放能量回到低能级,但分子振动仍停留在高能级,因此总的结果就像电子越迁没有发生,只有分子振动发生了。下图就是一个描述拉曼过程的示意图。首先解释一下这些线是干什么的,第一次看到这个图的人很容易产生疑惑,正如我当初一样。这里有上下两组线,上面那个组有两条线,下面那个组有五条线。上下这两组线就代表了电子运动的能量级,下面这组表示电子运动的基态即能量最低的轨道,上面有两个线那组就是电子运动的高能级,也就是激发态。前面讲过电子的能量比分子的振动或转动的能量要大的多,因此当电子处于基态时,即电子在低能级运动时,电子所在的分子可以有几个振动或转动的状态。以下面这一组线为例,下面这组线就说明当电子处于基态时分子有5种振动或转动状态。因为分子的振动和转动有能量重叠的可能性,因此这五条线或者表示振动,或者表示转动,因分子不同而不同,但在描述一般的波谱学现象,我们不对分子的振动和转动做进一步的区分。上面那两条线就是说当电子在高能激发态时,分子运动的振动或转动有两个能量级,一个高一个低。

   在此有必要对基态和激发态做一个评价。所谓基态就是能量最低时的运动状态,电子运动,分子运动都可以有基态激发态。对于多原子分子,不同的分子轨道对应于不同的外层电子结构。这些分子轨道在能量上是不连续的,通常情况下电子处于最稳定分子轨道上即分子的基态,当与光子发生相互作用后,分子会吸收光子的能量,跃迁到较高的能级——激发态。当分子处于相对不稳定的激发态时会自发通过释放能量返回基态。其释放能量的途径一般分为辐射跃迁和非辐射跃迁。所谓的非辐射跃迁只分子通过振动弛豫等途径返回基态,多余能量通过热能传递给周围介质。而辐射跃迁即分子通过发射一个光子来释放能量,我们称该过程为荧光发射,通过荧光发射发出的光称为荧光。同样以图2为例,最下面的那条线就是电子基态分子振动或转动基态,倒数第二条线就是电子基态分子振动或转动一级激发态,倒数第三条线就是电子基态分子振动或转动二级激发态,倒数第四条线就是电子基态分子振动或转动三级激发态,倒数第五条线就是电子基态分子振动或转动四级激发态,倒数第六条线就是电子激发态分子振动或转动态,倒数第七条线就是电子激发态分子振动或转动级激发态。有了这些基本概念的理解,下面的能量转化图就不难理解,红外就是电子基态分子振动或转动基态到电子基态分子振动或转动一级激发态的迁。拉曼与红外有一定关系,在实践中二者往往互补。                        

         

   图2;能量吸收和发射示意图,粒子能及用平行的直线表示。

   下面简单介绍一下核磁波谱,核就是原子核,核磁波谱顾名思义就是研究原子核的技术。在实践中我们从来不叫核磁波谱,大家都叫核磁共振,但从物理本质上说就是波谱技术的一种。与其它波谱技术的区别就在于这个磁子,其它没什么区别。核磁需要共振,红外波谱也需要共振,紫外光谱也需要共振,共振是微观世界能量转移,能量吸收,能量发射时都在发生的现象,不是核磁共振特有,只不过我们从来不说紫外共振波谱或红外共振波谱,听起来好像有些别扭或者这就是约定俗成的叫法大家都习惯了。磁就是磁场,就是说原子核的波谱要在磁场中进行,因为只有在磁场中某些原子核才会有量子化的能级,比如1H, 15N, 13C。原子核在磁场中的自旋可以平行于磁场方向,可以反平行于磁场方向,因此有两个能级。原子核在磁场中的能量级差别很小,即如果改变原子核在磁场中的运动状态,只需要非常小的能量,无线电波的波长最长,能量最小,所以我们只用无线电波就可以改变原子核在磁场的运动能级状态。在实践中,改变1H, 15N, 13C等不同原子核需要的能量也不同,因此需要的无线电波的频率也不同,比如在18.8T磁场强度下,13C核需要约200MHz的无线电电磁波激发,而1H需要约800MHz的电磁波激发。因为原子核在磁场中的能级差小,核磁共振是低敏感技术,但他是高分辩率的波谱技术,而且核磁共振可以用量子力学的手到精确的描述。核磁共振分为液态,固态和磁共振成像三个不同的方向,液态核磁的发展比较成熟,液态核磁可以用来研究蛋白质或其它生物分子的结构,动态或分子间的相互作用。固态核磁的发展滞后一些,但固态核磁可以用来研究膜蛋白等大分子。磁共振成像较为成熟,在医学上已得到广泛应用,可以检测软组织结构变化,磁共振成像主要检测水中1H原子在不同组织下的状态与化学环境。

波谱学与显微镜的实践需要光学的知识,我们将在下面的第三章介绍,波谱学与显微镜的应用领域广泛,但本书主要集中在他们的生物学应用,因此我们在第四章进行一些必要的生物学背景介绍,目的是希望有物理或光学背景的人能够有必要的生物学知识而加入到这个大有前途的研究领域。波谱学的基础是量子力学(经典物理学如牛顿力学和麦克思维(Maxwell)的电磁理论,而量子颗粒都有波粒二相性),虽然我们不想过多的介绍量子力学复杂的近似算法和原理,但基本的概念与理想系统的介绍还是必须的。能够用精确量子力学描述的系统只有理想体系和氢原子,其他的任何系统基本都需要近似的方法求解。我们以小球在一维空间的量子力学描述为例,通过这个简单例子的推导介绍一下量子力学的基本概念。




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