博文

SPEAC-seq：细胞互作的功能CRISPR筛选

已有 951 次阅读 2024-10-30 19:43 |个人分类:科普|系统分类:科普集锦

SPEAC-seq：细胞互作的功能CRISPR筛选

细胞互作在生理和病理中起着重要作用。例如，免疫系统依靠细胞间的交流来建立和调控针对病原体和肿瘤等目标的免疫反应。因此，确定基本的生理机制和治疗干预的候选靶点需要能够全面和公正地研究细胞通讯的工具。

细胞通讯的机制通常通过转录组学或蛋白质组学方法来研究，以预测基于细胞表达程序的相互作用分子。然而，基于CRISPR的筛选方法使全基因组遗传扰动研究能够定义调控感兴趣的生物过程的分子机制。这些技术已经推进了细胞内在调控机制的鉴定，但尚未广泛用于研究细胞互作、生物学后果和所涉及的机制。为了解决这一挑战，Faust等人开发了一种工具，用于系统扰动被包裹的相关细胞，然后进行测序(SPEAC-seq)。SPEAC-seq是一个使用全基因组CRISPR文库、液滴中细胞共培养和微流体分选平台，可以实现细胞互作调控因子的前向遗传筛选。

与其他方法比较

已经开发了几种方法来研究调控型细胞互作。一种方法是结合表达数据集和已知的配体-受体对来推断细胞之间的通讯。最近发展的空间技术结合了显微镜和分子图谱，可以检测共定位，并可以结合配体-受体相互作用的生物信息学预测。尽管生物信息学方法对产生假设很有用，但由于缺乏大规模实验测试预测的细胞互作方法，它们受到限制。

已经开发了各种方法在分子水平记录细胞互作，例如，通过邻近依赖性酶或光催化标记反应。也可以通过荧光团转移、条形码病毒转移或合成受体回路来标记附近的细胞。然而，这些方法通常依赖于对感兴趣相互作用的先验知识来对一个或两个相互作用伙伴进行基因工程，而通常也缺乏研究功能相互作用结果的能力。此外，流式细胞术对物理附着细胞的分析虽然适用于离体组织，而且不需要工程基因操作，但对弱膜相互作用或分泌因子的旁分泌信号缺乏敏感性。最后，逆转录病毒和酵母细胞可以被设计用于大分子文库筛选，以测试明确定义的蛋白质-蛋白质相互作用，但它们忽略了这些相互作用发生的生物学背景。

基于CRISPR的方法能够对调控感兴趣细胞过程的机制进行全基因组的探究。然而，这些方法通常应用于细胞内调控机制的研究。他们研究细胞间通讯的能力是有限的。因此，需要一个平台，能够使用基于CRISPR的方法，通过依赖接触和不依赖接触的机制来研究细胞通讯。液滴微流体方法广泛应用于单细胞基因组学，但也可用于研究细胞互作。因此，Faust等人开发了一个基于微流体的平台，将基于CRISPR的遗传扰动与细胞在液滴中共培养相结合，研究细胞通讯机制。

SPEAC-seq流程概述

简而言之，SPEAC-seq利用两个微流体装置进行细胞共包封和液滴分选，这些是使用软光刻制造的。慢病毒编码全基因组CRISPR筛选文库用于转导感兴趣的细胞并破坏单个基因。然后，通过微流体配对将单个基因被破坏的细胞和荧光报告细胞共封装在液滴中，然后在液滴中共培养。将含有共培养细胞的液滴进行荧光激活的液滴分选，以丰富液滴内部的遗传扰动导致报告基因激活。从富集报告基因激活的液滴中回收引导RNA，通过PCR扩增，并与没有报告基因激活的液滴进行比较(图1)。SPEAC-seq可在不到2周的时间内完成。

图1 SPEAC-seq工作流程概述。使用SU-8负光刻电阻，按照光刻技术制备微流控PDMS器件。使用氧等离子体将PDMS器件粘合到玻片上，并使用Aquapel处理使所得到的通道具有疏水性。扩增全基因组CRISPR敲除筛选文库，包装成慢病毒颗粒，稳定地转导待扰动的细胞群。根据需要准备报告细胞。在SPEAC-seq应用中，用全基因组CRISPR敲除文库转导原代小胶质细胞，并在阈值以下的细胞因子浓度下预刺激p65^EGFP NF-κB报告小鼠的原代星形胶质细胞以启动报告回路。用微流体装置将CRISPR筛选细胞和报告细胞共包封在单个液滴中。收集液滴乳液，细胞互作24小时。共培养的液滴被重新注入第二个微流体装置，该装置与激光、荧光检测器、FPGA和高压放大器联合操作，用于荧光检测和实时液滴分选。在微流控系统中检测NF-κB活化产生的报告荧光，并通过介电电泳对液滴进行正分选。收集正滴和负滴，并用全氟辛醇(PFO)将乳剂化学破碎以进行细胞回收。PCR扩增gRNA序列，制备文库进行测序

优点和应用

与上述其他方法相比，SPEAC-seq具有许多优点。微流体生成的受限共培养空间具有可控负载，确保分析的每个液滴模拟一对一的相互作用，不会像在体外或体内功能基因组筛选中那样，由于细胞丰度差异或混杂细胞类型存在而产生混淆效应。因此，SPEAC-seq提供了一个控制良好的环境，其中定义的相互作用伙伴配对最大限度地减少了技术分析的异质性。

SPEAC-seq在细胞互作控制组织稳态或病理的生物系统研究中得到应用。例如，SPEAC-seq已经成功地实现了对星形胶质细胞NF-κB激活的小胶质源性调控因子的发现，为神经炎症期间星形胶质细胞的神经炎症功能提供了机制见解。SPEAC-seq的进一步潜在应用包括无偏发现T细胞活化、抗原呈递或细胞毒性的调控因子。值得注意的是，SPEAC-seq适用于研究其他细胞类型是可能的，只需进行少量修改:即优化转染条件、共培养条件和荧光报告操作。由于几种荧光报告基因检测和基于CRISPR或其他功能基因组技术的功能基因组学平台的可用性，SPEAC-seq的适应潜力被放大了。因此，SPEAC-seq可用于研究多种生物过程的调控，如表观遗传调控、启动子激活、基因表达、RNA剪接、蛋白水平激活事件、受体信号传导和代谢功能等。尤其重要的是，SPEAC-seq的高可扩展性和吞吐量允许每次实验运行研究数千个扰动。SPEAC-seq很有潜力成为一个有价值的工具来研究多种生物学背景下细胞通讯的调控因子。

局限性

SPEAC-seq作为一种体外技术具有一些局限性，主要是由于其对生理细胞互作的有限再现。虽然来自基因工程小鼠品系的原代组织可以用作报告细胞，但是应用CRISPR筛选，需要在包封和相互作用筛选之前引入内切酶和靶向寡核苷酸。通过核糖核蛋白复合物的瞬态电穿孔对人源性细胞进行快速扰动的技术可能会将SPEAC-seq的应用范围扩大到培养细胞之外。由于SPEAC-seq研究的是导致荧光报告基因激活的相互作用，因此受到这些报告基因的可用性以及它们通过液滴中细胞互作的调控限制。此外，单个细胞在液滴中的培养存在营养物质可用性有限、气体交换不理想以及缺乏生长因子支持或细胞粘附/锚定等问题。这些因素限制了相互作用伙伴共培养的时间，并可能改变体内存在的组织特异性或环境特异性功能。尽管扩大SPEAC-seq用于全基因组筛选功能相互作用调控因子是可能的，但作为输入所需的细胞数量很大，对于某些细胞类型可能是不允许的。微流体封装技术的改进将提高捕获率并减少细胞损失。此外，SPEAC-seq协议所需的技术专长跨越分子生物学和昂贵的光学和电子系统工程，可能限制广泛使用。商业液滴分选器正在变得可用，此外，液滴的双重封装可能足以适应传统流式细胞仪的分选方案。

参考文献

[1] Faust Akl C, Linnerbauer M, Li Z, Lee HG, Clark IC, Wheeler MA, Quintana FJ. Droplet-based functional CRISPR screening of cell-cell interactions by SPEAC-seq. Nat Protoc. 2024 Sep 26. doi: 10.1038/s41596-024-01056-1.

以往推荐如下：

1. 分子生物标志物数据库MarkerDB

2. 细胞标志物数据库CellMarker 2.0

3. 细胞发育轨迹数据库CellTracer

4. 人类细胞互作数据库：CITEdb

5. EMT标记物数据库：EMTome

6. EMT基因数据库：dbEMT

7. EMT基因调控数据库：EMTRegulome

8. RNA与疾病关系数据库：RNADisease v4.0

9. RNA修饰关联的读出、擦除、写入蛋白靶标数据库：RM2Target

10. 非编码RNA与免疫关系数据库：RNA2Immune

11. 值得关注的宝藏数据库：CNCB-NGDC