未修饰的狂犬病mRNA疫苗引发高交叉中和抗体滴度和不同的B细胞记忆反应

摘要

基于全灭活病毒的许可狂犬病病毒疫苗对人类有效。然而，缺乏对引发的免疫反应的详细调查，以及是否可以使用新的疫苗平台改善反应。在这里，我们表明，与非人类灵长类动物中的两剂Rabipur相比，两剂脂质纳米粒制剂的编码狂犬病病毒糖蛋白(RABV-G)的未修饰mRNA疫苗诱导血液中RABV-G特异性浆细胞和T细胞以及骨髓中浆细胞的水平更高。mRNA疫苗也产生比Rabipur更高的RABV-G结合和中和抗体滴度，而两种疫苗的体细胞高突变程度和反应的克隆多样性相似。由mRNA疫苗诱导的更高的总抗体滴度转化为相关的狂犬病病毒株的交叉中和作用的改善，表明该平台具有开发针对这些病毒的广泛保护性疫苗的潜力。

介绍

狂犬病病毒(RABV)是一种嗜神经病毒，主要通过被感染动物的叮咬传播给人类。一旦病毒到达中枢神经系统(CNS)，急性脑炎、瘫痪和昏迷先于死亡。因此，在病毒传播后进入中枢神经系统之前，免疫系统只有有限的时间来中和病毒。死亡率和发病率的预防依赖于暴露后立即进行有效的暴露后预防(PEP)。这包括从接种过疫苗的马或人体中提纯的狂犬病免疫球蛋白(RIG )，以及多达五剂的狂犬病疫苗。可对处于危险中的个体，例如动物收容所的工作人员、兽医或旅行者，预防性地给予两到三剂。每年约有1700万人在暴露于RABV后接种疫苗并接受治疗。世界卫生组织(WHO)目前列出了四种基于灭活全狂犬病病毒的预先合格的狂犬病疫苗，其中一种是Rabipur，用于暴露前和暴露后预防。Rabipur疫苗已经使用了近40年，无疑拯救了无数生命。然而，对多剂量和高成本的需求导致了在流行地区的不完全保护和全世界每年约60，000例死亡。因此，研究现代疫苗技术是否能够改善对疫苗接种的免疫反应以及依从性和更高存活率的前景是及时的。

世卫组织提出了一个参考水平的病毒中和滴度(VNT )，作为足够的预防性狂犬病疫苗接种的阈值。暴露在病毒表面的狂犬病病毒糖蛋白(RABV-G)是中和抗体的主要靶标，也是疫苗的关键成分。RABV-G表现出五个不同的抗原位点，即I、II、III、IV和次要位点“a ”，所有这些都是利用从接受当前标准疫苗接种的个体中分离的单克隆抗体(mAbs)鉴定的。其中一些单克隆抗体(CR57；Rafivirumab和RVC20与位点I以及CR4098的结合；Foravirumab单抗，17C7结合位点III的Rab1和RVC58)已被提议作为RIG处理的替代物。由于存在几种RABV变异体，联合给药的单克隆抗体提供了更好和更广泛的中和活性。因此，狂犬病疫苗候选物的期望特征是它们产生靶向RABV-G上多个抗原位点的不同中和抗体。

在过去十年中开发的编码RABV-G复合于鱼精蛋白中的序列优化的核苷未修饰的mRNA疫苗在几个动物模型中显示出诱导针对致死性狂犬病病毒感染的中和抗体。这是第一个在I期临床试验中评估的mRNA疫苗。发现它是免疫原性的，具有可接受的耐受性。配方策略的进步已经用脂质纳米粒(LNPs)中递送的mRNA取代了游离的和鱼精蛋白复合的mRNA，这导致RABV-G mRNA疫苗在啮齿动物和非人灵长类动物(NHPs)中的免疫原性相当或改善。该制剂的第一次临床试验测试了安全性，以及以一剂或两剂低剂量(1、2和5 μg)给药时的血清转化，结果显示，在接受两剂给药的各组中，100%的受试者诱导的VNTs中和活性高于世卫组织阈值。然而，与三剂Rabipur相比，水平较低且动力学延迟，这表明需要改进mRNA疫苗接种策略以胜过Rabipur。

在这里，为了研究RABV-G mRNA疫苗与Rabipur相比诱导的免疫应答的质量和特征，我们用高剂量的mRNA疫苗(100 μg)对NHPs进行了肌内免疫，并对应答进行了深入表征，从引发后的早期先天免疫激活到一年后在纵向时间点采样的抗体的质量和特异性。结果表明，在这里测试的剂量下，mRNA平台的表现与批准的疫苗一样好，如果不是更好的话。

结果

用mRNA诱导的强而短暂的先天免疫激活进行疫苗接种

18只中国恒河猴被分成三个研究组，性别和体重分布相等(图.1a)。组1和组2接受100 μg mRNA疫苗，而组3接受人剂量的全灭活病毒疫苗Rabipur。第2组和第3组在第一次给药后4周分别接受第二次给药，以使用相同的免疫策略并排比较应答的特征。所有疫苗都是肌肉注射。在50周的研究期间，在多个时间点收集外周血和骨髓(BM)抽吸物。

图mRNA接种后I型IFN和中间单核细胞的诱导。a关于组和疫苗分配、组组成、疫苗剂量/给药途径、疫苗剂量数、每次剂量之间的时间间隔和采样时间表的研究设计概要。红色、绿色和蓝色将分别作为原稿中第1、2和3组数据的颜色编码。研究时间线上的全黑圆圈和空白圆圈分别表示抽血和骨髓抽吸。b可检测的血浆细胞因子和趋化因子水平的点状图显示了通过30-plex测定法测量的各组之间的显著差异。显示的值是指在第0天(初次免疫前)、第1天(峰值反应)和第14天(回到稳态水平)测得的水平。显示了组合的第1组和第2组(在本研究中，它们都接受了一剂mRNA疫苗，因此是等效的)和第3组之间每种细胞因子的直接比较。n= 18种生物独立的动物。在第1天，使用Mann-Whitney对各组之间的统计差异进行评估U测试。未检测到或低于定量下限(LLOQ)的细胞因子浓度显示为LLOQ值。虚线表示LLOQ。代表性流式细胞仪图(c)和纵向数据(d)显示了中间单核细胞的分化和暂时波动。显示了第0天(初次免疫前)、第1天(先天应答峰值)和第14天(回到稳态水平)的数据。用于识别单核细胞的完整门控策略见补充图.11b。统计差异在(d)在第1天使用Mann–Whitney进行评估U测试。n= 18种生物独立的动物。比较研究组的所有统计检验都是双尾检验。所有误差线表示平均值±SD。

我们首先研究了mRNA疫苗和Rabipur之间早期先天免疫激活的差异。mRNA疫苗诱导干扰素α(IFNα)以及IFN诱导的I-TAC/CXCL11的血清浓度显著增加，这在Rabipur组中是检测不到的(图.1b)。此外，mRNA疫苗诱导了更高水平的白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1RA)、单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)和趋化因子嗜酸性粒细胞趋化因子。免疫后两周，细胞因子恢复到基线水平(图.1b)。大多数测试的细胞因子在免疫后24小时显示没有或非常低的系统增加(补充图.1)。与细胞因子/趋化因子分泌的短暂增加相一致，循环CD14 + CD16 +中间单核细胞在24小时时明显增加，这在mRNA疫苗接种后再次更加明显(图.1c，d)。临床化学和全血计数(CBC)显示，在用任一疫苗免疫后，没有波动或波动很小，仍在正常范围内(补充图.2a，b)。两种疫苗都没有引起体温升高(补充图.3a)，也不会随着时间的推移对体重产生负面影响(补充图.3b)。循环淋巴细胞、总单核细胞和树突细胞(DC)亚群没有显著或持续的波动(补充图.3c).总的来说，我们观察到mRNA疫苗的瞬时先天免疫激活更明显，并且1型IFN极化。

mRNA疫苗诱导更高水平的RABV-G特异性抗体、成熟浆细胞、浆细胞、记忆B细胞和T细胞

初次免疫后两周，除一只动物外，所有动物的狂犬病毒中和抗体(RVNA)滴度均高于世卫组织推荐的阈值(图.2a和补充图.4a)。与mRNA接种组相反，Rabipur组在初次接种后4周显示滴度下降(图.2a)。随着mRNA疫苗和Rabipur的加强免疫，滴度进一步增加。在第18周，所有三个组中的RVNA滴度都高于世卫组织阈值。在超过第18周和整个50周的研究期间，只有加强的mRNA组在所有动物中显示出持续高于该阈值的滴度(图.2a和补充图.4a)。RABV-G结合IgG滴度显示出与中和滴度相似的动力学(图.2b和补充图.4b)。接种疫苗后，所有组均可检测到RABV-G特异性IgM水平(补充图.4c)。

图2 mRNA疫苗接种的较高水平的体液和细胞反应。a在整个研究时间表中显示了中和抗体滴度。箭头表示免疫接种。根据补充图4a，使用Kruskal-Wallis检验计算峰值抗体反应(第6周)和研究结束时(第50周)的统计显著性。连接线表示组平均值。虚线表示RVNA滴度为0.5 IU/mL，这是世卫组织建议的VNT阈值。n= 18种生物独立的动物。b总IgG滴度表示为半最大有效浓度(EC50)用ELISA测定的样品稀释系列计算，显示在整个研究时间线上。箭头表示免疫接种。连接线表示组平均值。n= 18种生物独立的动物。根据补充图，使用Kruskal-Wallis检验计算峰值抗体反应(第6周)和研究结束时(第50周)的统计显著性。4b. c在加强免疫前(基线)和加强免疫后4天，通过B细胞ELISpot测量抗原特异性成浆细胞。n= 18种生物独立的动物。在第4天使用Mann-Whitney评估统计差异U测试。误差线表示平均值±SD。d在不同的研究时间点，通过B细胞ELISpot计数骨髓中分泌抗原特异性抗体的浆细胞的纵向数据。n= 18种生物独立的动物。使用Kruskal-Wallis检验计算峰值抗体反应(第6周)和研究结束时(第50周)的统计显著性。代表性流式细胞仪图(e)和纵向数据(f)显示了抗原特异性记忆B细胞的产生和扩增。显示了第1周(初次免疫前)、初次免疫后2周(第2周)、加强免疫后2周(从研究开始的第6周)以及从稍后的时间点(第18周)开始的数据，从该时间点也已经分选了单细胞。n= 18种生物独立的动物。在第2、6和18周使用Kruskal-Wallis检验计算统计显著性。误差线表示平均值±SD。代表性流式细胞仪图(g)和纵向数据(h)显示了抗原特异性Th1细胞的产生，其通过用覆盖整个RABV-G蛋白的重叠肽库刺激时产生细胞内IL-2和IFN-γ的能力来鉴定。显示了在免疫前(第0周)、初次免疫后2周(第2周)和加强免疫后2周(从研究开始第6周)收集的未刺激和刺激细胞的数据。n= 18种生物独立的动物。在第6周使用Kruskal-Wallis检验计算统计显著性。比较研究组的所有统计检验都是双尾检验。误差线表示平均值SEM。

在加强免疫后的第四天，通过ELISpot很容易检测到分泌抗体的RABV-G-特异性成浆细胞，与Rabipur组相比，在mRNA初次加强免疫组中观察到更高的频率(图.2c)。在所有组中初次免疫后，骨髓中的RABV-G特异性浆细胞是可检测的(图.2d)。这些数字在加强免疫后两周增加，并显示与许可的疫苗相比，mRNA接种组的水平显著更高。虽然仅接受一次mRNA疫苗免疫的组在研究结束时(第50周)没有显示出可检测的水平，但在整个研究期间，在两个初免-加强组中RABV-G特异性浆细胞仍然是可检测的，此时各组之间的数量没有差异(图.2D和补充图.4d)。RABV-G特异性循环记忆B细胞(MBC )，如通过流式细胞仪结合荧光标记的RABV-G所测量的，显示在mRNA组中加强免疫后数量明显增加，并且在mRNA和Rabipur初次加强免疫后18周仍可检测到(图.2e，f)。重要的是，在第50周时，MBC衍生的抗体分泌细胞仍然可以通过ELISpot在mRNA组中检测到，特别是在初次-加强组中(补充图.4e)。

RABV-G特异性记忆T细胞，如通过使用重叠RABV-G肽刺激和细胞内细胞因子产生的抗原回忆试验所评估的，显示mRNA疫苗组在初次免疫后具有低但可检测的CD4+ T细胞应答，在加强免疫后明显增加(图.2g)。如IFN-γ和IL-2产生所证明的，T细胞反应是Th1极化的(图.2h)，并且没有或非常少的细胞产生IL-13、IL-21或IL-17A(补充图.5a、b)。然而，应该注意的是，对于Th2和Tfh应答，细胞内细胞因子的产生本质上更难以检测(如补充图中的SEB对照所证明的)。这可能会导致对Th1和Th2/Tfh比值的过度解读。Rabipur组未显示出可检测的CD4+ T细胞反应。CD8+ T细胞反应在所有组中都很低或检测不到(补充图.6a–f)。总的来说，数据表明，mRNA疫苗的两剂量策略诱导了比灭活病毒疫苗显著更高的抗体滴度，以及对抗体产生和应答的持久性至关重要的RABV-G特异性细胞群。

在所有组中，RABV-G结合IgG水平和中和滴度之间有很强的相关性，表明这些抗体的数量与其质量相当(图.3a)。在Rabipur组中，与RABV-G相比，Rabipur疫苗本身的结合滴度没有差异(补充图.7a)并且在Rabipur和RABV-G的滴度之间以及Rabipur和中和之间有很强的相关性(补充图.7b)。因为与仅编码RABV-G的mRNA疫苗相比，Rabipur是灭活的完全病毒疫苗，所以Rabipur也可能诱导对额外抗原的应答。我们发现，与疫苗接种前或mRNA免疫组观察到的背景结合相比，Rabipur组中RABV-核蛋白(N)-特异性IgG水平没有显著增加(补充图.7c)。该数据表明，如前所述，两组中大多数中和作用都是由RABV-G特异性抗体介导的。然而，需要从样品中去除抗RABV-G抗体，以明确显示抗体对其他RABV蛋白是否也有中和作用。

图3:由两种疫苗诱导的高质量中和抗体。a中和(RVNA)和总结合抗体之间的Spearman相关性，以半最大有效浓度(EC50)表示)的总IgG与RABV-G的结合率。b模拟抗体随时间的衰减直至EC50 80.9相当于基于抗体半衰期估计的每组0.5 IU/mL。使用适合每种动物的模型进行了长达十年的模拟。计算每只动物与检测目标结合的时间，并报告每组的总结。显示了95%置信区间。cELISA检测抗体亲和力。显示了初次免疫后1个月(第4周)、加强免疫后1个月(从研究开始起第8周)和稍后时间点(第18周)收集的血浆在温和尿素洗涤后剩余的结合百分比。n= 18种生物独立的动物。使用Kruskal–Wallis检验计算统计显著性。误差线表示平均值±SD。

为了解决RVNA滴度长期维持在世卫组织保护阈值以上的问题，我们计算了RVNA和RABV-G结合滴度的半衰期估计值，并使用模型拟合对每只动物模拟了抗体随时间的衰减(补充图.8a、b)。由于RVNA滴度的半分类性质，我们用总RABV-G结合滴度代替RVNA进行模拟，并使用EC50 80.9的目标。通过数据插值，该值对应于0.5 IU/mL的世卫组织阈值(图.3b和补充表格1).。模拟表明，用mRNA疫苗初免-加强诱导的RABV-G结合滴度可能需要长达3.5年(190周)才能降至阈值以下。仅用mRNA疫苗进行初次免疫，在用Rabipur进行初次加强免疫后需要2.5年(136周)和< 1.5年(73.4周)。然而，应该注意的是，接受两剂Rabipur的动物比接受单剂mRNA疫苗的动物具有更高的峰值中和作用(图.2a)。尽管抗体结合滴度较低(图.2b)表明由两剂全灭活病毒疫苗诱导的反应在质量上更好。

总之，这些数据表明，两种疫苗都产生具有高效力的中和抗体，但是mRNA疫苗诱导了更高的滴度，导致了高于保护阈值的更持久的反应。两种疫苗诱导的高质量抗体应答进一步得到了以下事实的支持，即在离液剂存在下，与RABV-G结合强度的降低表明接受两剂mRNA疫苗的动物与接受两剂Rabipur的动物之间没有差异(图.3c)。

mRNA疫苗和Rabipur刺激了相似水平的体细胞超突变

多个免疫参数表明，与许可的Rabipur相比，当比较相同的两次剂量、间隔4周的免疫方案时，mRNA疫苗诱导了更高强度的反应，这不同于目前推荐的狂犬病暴露前预防接种方案。然而，选择这种研究设计是为了能够对任一疫苗引发的抗体进行定性比较。因此，我们对接种了两剂疫苗的人群进行了更详细的评估。为了评估抗体在克隆性和RABV-G表位特异性方面的定性差异，我们对来自RABV-G特异性MBC的免疫球蛋白重链可变区(HV)进行了测序，这些抗体在第8周和第18周进行单细胞分选。我们分别从mRNA疫苗组和Rabipur初免-加强组的410和506个单MBC中获得了高产和高质量的序列。HV区域的体细胞高突变(SHM)水平通过将序列分配到基于多只恒河猴的最大猕猴种系IGHV等位基因数据库KIMDB来计算。两组均表现出RABV-G特异性MBCs的每只动物平均SHM持续增加的趋势，从加强后2周至加强后12周。然而，在两组之间没有观察到SHM的差异(图.4a)。

图4:类似地，mRNA和Rabipur诱导体细胞高突变，并且不需要中和。a显示不同组和时间点每只动物的抗原特异性Sanger序列的SHM平均水平的Violin图.线条代表组平均值。使用非配对数据的Mann-Whitney检验和配对数据的Wilcoxon符号秩检验计算统计显著性。b通过所有组的VDJH氨基酸抗原特异性序列的多重序列比对推断的最大似然树。该树按比例绘制，分支长度与用于推断系统发育树的进化距离单位相同。比例尺表示每个序列位置0.2个置换的距离。这项分析涉及334个氨基酸序列。与位点I和位点III结合的参照狂犬病抗体分别用洋红色和青色条表示。根据最低、中等和最高SHM(命名为LowRab1-4、MedRab1-4和HighRab1-4)以及可能时根据与参考抗体的接近度，选择12个序列用于克隆单克隆抗体。c三聚体RABV-G模型的顶视图和侧视图，抗原位点I和III分别用洋红色和青色突出显示。PMDB ID: PM0079619。d结合效力(EC50)与参考狂犬病抗体和阴性对照一起显示。浅灰色、深灰色和黑色条分别表示具有最低、中等和最高SHM (LowRab、MedRab和HighRab)的单克隆抗体。洋红色和青色条分别指与位点I和位点III结合的参照狂犬病抗体。e克隆单克隆抗体与参照狂犬病单克隆抗体之间的竞争概述。从红色到蓝色的颜色梯度表示高到没有竞争。fSHM百分比和中和之间的Spearman相关性(IC50)在不同的克隆单克隆抗体中。虚线表示中和的检测限(LOD )，对应于分析中使用的最高mAb浓度(5 μg/mL)。比较研究组的所有统计检验都是双尾检验。

我们接下来评估了狂犬病病毒中和抗体活性是否需要高SHM。我们从分选的RABV-G特异性B细胞的氨基酸重链VDJ序列构建了最大似然种系发生树，也包括从接受一剂mRNA疫苗的动物中获得的67个序列(图.4b)。我们选择了12组配对的重链和轻链序列用于单克隆抗体的表达。根据SHM的程度进行选择，包括四种具有最低SHM的单克隆抗体(0–0.7% SHM；命名为LowRab1-4)，四个具有中等水平SHM(1.7–4.4% SHM；命名为MedRab1-4)和具有最高SHM(5.4–9.2% SHM；命名为HighRab1-4)(图.4b)。与治疗药物序列相似和其它先前表征的广谱反应性狂犬病病毒中和单克隆抗体与RABV-G上的位点I或位点III结合(图.4c)在评选中被考虑在内。发现12种单克隆抗体中的8种结合RABV-G(补充图.9a和图.4d)。其中六种抗体的结合能力与参照的狂犬病毒中和单克隆抗体相当(图.4d)。通过在不同参照单克隆抗体存在下与RABV-G结合的竞争，进一步研究了八种RABV-G结合单克隆抗体的特征(补充图.9b)。分析显示，三种单克隆抗体(LowRab1、LowRab2和HighRab1)与Rafivirumab和RVC20(位点I-结合)强烈竞争，另外三种单克隆抗体(MedRab1、MedRab3和LowRab3)与Foravirumab、Rab1和RVC58(位点III-结合)中度竞争(图.4e)。HighRab1显示出与Foravirumab、Rab1和RVC58的中度/低度竞争，这可能表明通过空间位阻和/或由于与位点I的成角度结合而干扰了位点III结合的mab。HighRab2和HighRab3不与任何参考抗体竞争，尽管该结果可能反映了这两种mab在表达的mab中显示出总体上最弱的可检测结合的事实(图.4d)。我们最后测试了八种单克隆抗体中和狂犬病毒的能力，并将数据与SHM的程度相关联。八种单克隆抗体中的四种(HighRab1、MedRab1、MedRab3和LowRab3)显示了针对狂犬病病毒的有效中和活性。因此，RABV-G中和抗体不需要高SHM，但这可能取决于靶向哪个表位(图.4f)。

mRNA疫苗接种产生了广泛的反应性抗体，并随着时间的推移而保持

我们进一步评估了两种疫苗诱导的反应的克隆性，并询问不同的表位特异性是否可以解释反应的定性差异。我们从RABV-G特异性Sanger序列构建了系统发育树(补充图.10a，b)。来自已知狂犬病病毒中和单克隆抗体的序列被包括作为参考点。不同组的系统进化树显示了总体高度的相似性，这表明mRNA和Rabipur疫苗在大多数HV基因家族中都引发了抗体(补充图.10a，b)。为了增加测序深度，我们在第18周对所有动物进行了大量IgG全序列测序，产生了约1250万个读数。此后，我们使用从单一记忆B细胞分类中鉴定出的重链序列作为查询序列，以鉴定大量文库中的克隆相关序列。通过这种方法，我们确定了987个与IgG库内RABV-G特异性Sanger序列相关的序列。两组都诱导了不同的HV等位基因使用，与多克隆反应一致(图.5a)。我们观察到RABV-G特异性B细胞中不同等位基因的富集，这些细胞也经常用于我们动物的总IgG库，以及先前描述的IgM库。两组中的克隆分布存在供体可变性，一些动物具有扩增的克隆，而其他克隆仅由单一序列代表(图.5b)。这表明mRNA和Rabipur疫苗接种都诱导不同克隆的动员。当我们评估每组的样本覆盖率时，稀疏曲线显示，当向下采样到500个序列时，Rabipur样本覆盖率可达到约75%，而mRNA组仅为约50%。这表明，与Rabipur相比，mRNA疫苗可能引发了更多样的克隆型募集和扩增(图.5c).通过使用物种丰富度多样性算法(Chao1)进一步估计每个个体的克隆型多样性。由于样本量有限，我们观察到mRNA接种组的物种丰富度有增加的趋势(图.5d)。

图5:与Rabipur相比，mRNA诱导更高水平的多样性和交叉中和抗体。a热图显示每只动物每个接种组的IGHV等位基因使用情况，包括Sanger序列和大量HTS。总IgG库被二次取样至每个个体100，000个序列，显示了120万个序列。针对每组的序列总数调整标度，所得值经log10转换。b显示合并数据集中克隆相关序列的不同簇的比例的条形图(定义为具有相同的V和J等位基因、精确的HCDR3长度匹配、至少一个相同的核苷酸连接和HCDR3的80%氨基酸同一性的那些)。c基于每组克隆型计数的样本覆盖率估计，其中值1表示对整个群体进行了抽样。连续的彩色线代表平均值，而每条线周围的颜色代表95%的置信区间。d两个群体每个个体的克隆型计数的物种丰富度估计(Chao1)。对最低数量的序列进行了100倍的二次抽样估计，绘制了单个平均值。箱线图中心测量值是平均值，方框的边界代表四分位数范围(50%百分位数)，胡须代表四分位数范围上限或下限的1.5倍。n= 10种生物学上独立的动物。使用Mann-Whitney检验计算统计显著性，p-值= 0.48。e循环抗体与七种参考狂犬病单克隆抗体之间的血浆竞争汇总，量化为每份血浆样品的ug/mL位点竞争抗体。在第8周(加强后两周)测量血浆竞争。n= 18种生物独立的动物。误差线表示几何平均值几何标准差。f在研究开始后第47周(加强后42周)测量的针对几种狂犬病病毒株的血清中和滴度。数据以世卫组织国际单位表示。0.5 IU/mL被认为是阳性中和的临界值，显示为虚线。n= 18种生物独立的动物。使用曼-惠特尼检验计算统计显著性。比较研究组的所有统计检验都是双尾检验。误差线表示几何平均值几何标准差。

为了评估疫苗诱导的循环抗体之间是否也存在不同的结合特异性，我们评估了在加强免疫后一个月收集的血浆中存在不同参考单克隆抗体的情况下与RABV-G结合的竞争。分析表明，在mRNA接种组中诱导的血浆抗体靶向RABV-G上的所有抗原位点I、II和III，并且与Rafivirumab之外的所有参考mab相比，具有更强的竞争性(图.5e，补充图.12)。这表明，mRNA疫苗和Rabipur疫苗都引发了不同的反应，尽管该组中较低的滴度可能会限制反应的广度。最后，我们询问在mRNA疫苗组中，针对RABV-G上多个抗原位点的增强的强度和广泛的抗体应答是否也能提高针对不同物种的狂犬病病毒的中和活性。测试了针对狂犬病病毒株CVS-11的中和能力，同时测试了来自类群I的欧洲蝙蝠病毒1 (EBLV1)和Duvenhage病毒(DUVV)、类群II的Lagos蝙蝠病毒(LBV)和类群III的Lleida蝙蝠病毒(LLBEV)。当所有动物的抗体水平都下降到平台期时，在初次免疫后47周采集的样品中测试交叉中和能力。所有mRNA免疫的动物都显示出对EBLV1和DUVV的交叉中和反应，而Rabipur免疫的动物中的中和反应显著较低(图.5f)。两组均未发现对LBV或LLBEV的中和作用。总之，我们的数据表明RABV-G编码的mRNA疫苗比Rabipur疫苗能诱导更高水平的交叉中和抗体。

讨论

依靠负担得起的疫苗，世卫组织的目标是到2030年狂犬病零死亡。目前许可的基于全灭活病毒的狂犬病疫苗已证明具有可接受的效力和耐受性。然而，它们是市场上最昂贵的疫苗之一，根据所遵循的方案以及疫苗是在暴露前还是暴露后施用，需要2至5剂。在流行地区，主要是在亚洲和非洲，大量的所需剂量经常导致不能完全遵守完整的疫苗接种方案。mRNA疫苗平台有潜力克服与疫苗成本和剂量要求相关的一些挑战。mRNA的无细胞体外转录可以比细胞培养的感染性病毒的纯化更具成本效益，并且它是可扩展的，正如在新型冠状病毒疫情期间所证明的。在临床I期研究中测试了编码RABV-G的未经核苷修饰的mRNA疫苗，目的是开发需要更少剂量的疫苗。然而，需要进一步开发以确定具有可接受的耐受性同时具有高免疫原性的剂量。本研究的主要目的是比较肌肉注射后RABV-G mRNA疫苗诱导的免疫应答的数量和质量，与已获许可的全灭活病毒疫苗Rabipur诱导的免疫应答进行比较。重要的是，该研究使用相同的给药方案进行，以便对疫苗进行直接比较。因此，需要进行进一步的研究，以对照在推荐的方案中使用最多五次剂量的Rabipur。

I型IFN和先天免疫激活的特征性诱导可能在mRNA疫苗接种后Th1极化抗原特异性适应性反应的诱导中起作用。已经证明I型IFN应答直接支持B细胞分化和存活，导致增强的抗体应答。诱导I型IFN的佐剂如TLR3、7/8和9-配体(聚IC:LC、R848、CpG)导致抗体半衰期和体液反应的持久性增加。在目前的研究中，我们观察到mRNA疫苗诱导了强烈和短暂的I型IFN应答(IFNα，CXCL11)，以及单核细胞活化，这由MCP-1分泌和给药24小时内中间单核细胞分化水平增加所证明。我们和其他人先前已经发现，在施用核苷修饰的和未修饰的mRNA疫苗后，有相似的活化特征。中间单核细胞对于CD4+ T细胞的抗原呈递是重要的并支持幼稚B细胞分化为分泌抗体的成浆细胞。因此，与全灭活病毒制剂如Rabipur相比，由mRNA疫苗诱导的先天免疫谱可能有助于产生更高水平的抗原特异性Th1偏斜CD4+ T细胞、成浆细胞和记忆B细胞。

病毒暴露后预防狂犬病依赖于RABV进入中枢神经系统前迅速的抗体介导的中和作用。在我们的研究中，一次mRNA疫苗免疫诱导的抗体滴度相当于两次Rabipur剂量。然而，这两个研究组都没有持续保持长期RVNA滴度高于世卫组织推荐的阈值。相比之下，与Rabipur相比，mRNA初始加强组中的所有动物持续产生更高的滴度，并且在第一次免疫后一年呈现远高于世卫组织阈值的RVNA滴度。因此，mRNA疫苗可能非常适用于两剂量方案的暴露前预防。同时，只有在施用至少三剂Rabipur后，人类才有完全的血清转化和稳定的免疫力。mRNA疫苗也可能是一种有吸引力的暴露后策略，特别是在当前疫苗和RIG/mAbs可用性差的情况下，对多剂量疫苗接种方案的依从性很差。mRNA疫苗诱导长期免疫反应的能力也可能是针对目前使用全灭活疫苗制剂的其他病原体的有效疫苗接种策略。疫苗诱导的抗体滴度下降会增加突破性感染的风险，如针对新型冠状病毒的mRNA疫苗所示。这些数据强调了在疫苗接种研究中监测抗体持久性的重要性。在这项研究中，我们发现mRNA疫苗平台诱导的抗体滴度与基准全灭活病毒疫苗相似。

尽管mRNA疫苗显示了更高水平的细胞反应和抗体水平，但两种疫苗都诱导了具有高中和能力和亲和力(结合强度)的抗体。事实上，结合滴度与RVNA滴度的相关性表明，在Rabipur组中，与mRNA相比，中和效价或中和与总结合的比率稍高(图.3a)。因此，用mRNA疫苗观察到的中和作用的提高可能主要是由于抗体滴度的增加。为了了解记忆B细胞区室中是否存在定性差异，我们对RABV-G特异性记忆B细胞的免疫球蛋白重链可变区进行了测序，并通过归属于已建立的恒河猴种系序列数据库来评估SHM的程度。我们观察到两剂mRNA疫苗或Rabipur后SHM水平相似。我们和其他人已经表明编码各种病毒抗原的mRNA疫苗诱导了高水平的生发中心(GC)反应和Tfh活化。高度的SHM通常会提高抗体与抗原的结合亲和力，这对于中和包括HIV-1病毒、流感病毒和丙型肝炎病毒(HCV)在内的几种病毒病原体是至关重要的。虽然我们描述了具有非常低的SHM的单克隆抗体的例子，这些单克隆抗体是有效的狂犬病中和剂，这也在其它急性细胞病变病毒如狂犬病样水泡性口炎病毒(VSV)中观察到SHM在更大范围的狂犬病中和抗体中的作用仍有待研究。

使用来自接种动物的大量IgG库的高通量测序(HTS)、分离的RABV-G特异性B细胞的Sanger测序和一组表达的mAbs，我们证明了两种疫苗诱导不同的记忆B细胞库。尽管测序深度稍高，但Rabipur组的独特克隆数量较少。然而，需要更多的数据来研究在诱导不同的B细胞克隆方面是否存在差异。无论如何，我们的数据显示，与Rabipur相比，mRNA疫苗似乎并不限制应答。我们证实了表达的单克隆抗体对RABV-G上的不同表位是特异性的，并且一些是有效的中和抗体。在接种动物的血浆中也发现了mRNA疫苗引发对RABV-G具有广泛特异性的抗体反应的能力。可以想象，用β-丙内酯对病毒进行化学灭活(如用于Rabipur)可改变抗原特性，并可能破坏某些表位(如在其他病毒制剂中发现的)。此外，在小鼠模型中已经证实，来自mRNA疫苗接种的膜结合抗原通过降低将细胞募集到GCs中所需的亲和力阈值，在激活B细胞方面比蛋白质疫苗更有效。覆盖RABV-G上更多抗原位点的广泛反应对于针对不同RABV变体和狂犬病病毒的中和活性可能是重要的。在我们的研究中，我们注意到mRNA疫苗组的交叉中和作用增强，虽然这可能主要是由于诱导了更高的滴度，但这仍然是该疫苗的一个重要作用。

包括抗狂犬病DNA疫苗在内的核酸疫苗已经在动物模型中成功测试了多年。当前研究中的mRNA疫苗已经开发了好几年。编码RABV-G的第一代mRNA疫苗与鱼精蛋白复合，并在安全性和免疫原性方面在人体中显示出有希望的结果，通过无针装置肌肉注射或皮内注射高达400 μg疫苗。用LNP配制的类似mRNA疫苗在肌肉注射5 μg后产生不可接受的高反应原性；然而，1或2 μg剂量的耐受性良好。这些较低剂量的初免-加强方案引发的RVNA滴度高于世卫组织阈值，但滴度较低，且动力学比标准三剂量的拉比普引发的低。在我们的研究中，在NHPs中施用两次100 μg剂量的相同LNP配方mRNA疫苗没有显示出任何关于体温、血液学或毒性的安全性问题。此外，与两剂Rabipur相比，两剂mRNA疫苗显示出改善的免疫原性。然而，与人类相比，NHPs通常对疫苗不良事件更有抵抗力，在解释安全性数据时必须考虑这一警告。人类和NHPs之间mRNA疫苗反应原性的差异可以用对I型IFN相关炎症耐受性的生物学差异来解释。在保持良好的抗原表达和高质量抗体的同时，也需要对mRNA进行修饰来改变I型IFN。此外，对于这种mRNA平台，mRNA非翻译区的改进已被描述并证明在新型冠状病毒的NHP模型中更具免疫原性和保护性62。需要对疫苗剂量进行进一步研究，以在可耐受的先天免疫活性、适应性免疫应答的数量和质量以及未修饰的mRNA疫苗提供的免疫保护的持久性之间取得平衡。

总之，我们在此表明，与两次剂量的许可疫苗Rabipur相比，两次剂量的100 μg编码RABV-G的核苷未修饰的LNP配方mRNA免疫NHPs诱导了更有效和持久的RABV中和作用。两剂mRNA疫苗产生的RVNA滴度预计将在三年多的时间里保持在世卫组织阈值以上。由于mRNA疫苗诱导了更强的中和作用和更高频率的B细胞和浆细胞，该平台可能是目前许可的用于暴露前和暴露后预防的狂犬病疫苗的有利替代物。此外，mRNA疫苗可以避免生产和纯化全灭活病毒疫苗的问题，并且可以设计成以最佳构象和稳定的融合前三聚体表达RABV-G。进一步完善mRNA设计、剂量和免疫方案的研究需要在人类中进行。尽管如此，目前的研究为mRNA疫苗诱导的反应提供了重要的机制见解，这有助于开发针对RABV和其他病原体的这种类型的疫苗模式。

方法

疫苗

在这项研究中使用了一种实验性和一种许可的狂犬病疫苗。这些是编码巴斯德株(GenBank登录号:AAA47218.1)的狂犬病病毒糖蛋白(RABV-G)的未经核苷修饰的mRNA，由CureVac SE生产，并如前所述使用Acuitas Therapeutics (Vancouver，Canada)的脂质纳米颗粒(LNP)技术封装，以及用作基准对照的灭活全狂犬病病毒疫苗Rabi pur(FLURY LEP株)。为简单起见，实验疫苗在整个手稿中被称为“mRNA”。每个疫苗剂量由100 μg mRNA或人用Rabipur的全部推荐剂量组成，两者均在0.5 mL无菌0.9% NaCl中制备。

研究设计、样本收集和疫苗安全性评估

这项研究(18427–2019)由斯德哥尔摩地区动物实验伦理委员会批准。十八只中国恒河猴(猕猴)，雌雄各半。根据适用的指南饲养动物，并根据欧洲实验室动物科学协会联合会(FELASA)的欧洲动物福利和护理指南开展工作。在卡罗林斯卡学院的Astrid Fagraeus实验室(AFL )，雄性和雌性被分别关在两个大笼子里。将动物分成三个研究组，保持相似的性别和体重分布。组1和组2接受mRNA疫苗，而组3接受Rabipur。第2组和第3组在初次免疫4周后接受加强免疫，而第1组仅接受初次免疫。所有疫苗均通过右三角肌肌内(IM)针注射给药。外周血和骨髓(BM)抽吸物在初次免疫前1周开始收集，并在随后50周的不同时间点收集。研究设计的总结见图.1。在每次取样前监测所有动物的健康参数，如体重和体温，同时在免疫当天、1天后和14天后收集额外的安全性数据，即临床化学(主要监测肝和肾功能)和全血计数(CBC)。临床化学和全血细胞计数由Adlego Biomedical进行。近似的T细胞和B细胞计数由流式细胞仪数据(稍后描述)获得的相应细胞亚群比例计算，总淋巴细胞计数由全血计数获得。

与先天免疫激活相关的血浆细胞因子和趋化因子的定量

根据制造商的说明，使用Procartaplex细胞因子和趋化因子NHP 30-plex面板试剂盒(ThermoFisher)分析了疫苗接种早期阶段与先天免疫激活相关的一组血浆细胞因子和趋化因子的调节。在连接到Bioplex Manager软件(Bio-Rad)的Luminex xMAP仪器上采集样品。将获得的细胞因子绝对值内插到标准曲线中，以计算最终浓度。

接种后单核细胞分化的评估

单核细胞和其他白细胞亚型(包括嗜中性粒细胞、树突细胞(DC)、自然杀伤细胞(NK)、T和B细胞)的分化在初次免疫当天收集的新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)上进行评估，然后在1天后和14天后通过流式细胞术进行评估(补充图.11a)。使用了针对不同谱系标记的荧光标记抗体的不同组合(补充表2a)并如补充图所示进行识别。

疫苗接种后抗原特异性T细胞应答的评估

如前所述，基于抗原召回时细胞内细胞因子的产生，在不同的时间点对来自冷冻保存的PBMC的成批抗原特异性记忆T细胞进行分析。简而言之，在存在10 μg/mL Brefeldin A (Sigma-Aldrich)的情况下，用1 μg/ml跨越RABV-G蛋白的重叠肽(JPT)刺激100-200万个PBMCs，其中1 μg/mL SEB作为阳性对照，含有DMSO的培养基作为阴性对照。在BD LSRFortessa流式细胞仪上采集样品，并使用Flowjo第9版(BD Life Sciences)分析数据。刺激后，用一组荧光标记的抗体对细胞进行染色(补充表2d)，并使用BD LSRFortessa流式细胞仪(Becton Dickinson)获得。使用Flowjo版本10分析数据。响应抗原刺激产生细胞因子的t细胞被鉴定，如补充图所示5a。

狂犬病病毒中和作用的评估

狂犬病病毒中和抗体(RVNA)的纵向评估通过快速荧光灶抑制试验(RFFIT)进行，使用攻击病毒标准株(CVS-11)，使用所有时间点的血浆样品，并根据标准程序表示为国际单位(IU/mL)。在第47周评估对不同狂犬病病毒的交叉中和作用。使用改良的荧光灶抑制试验(RFFIT)进行RABV特异性中和抗体(VNA)的评估，基本上如前面所述使用RABV (CVS-11)作为试验病毒。血清在BHK21-BSR/5 (CCLV-RIE 0194/260)细胞上以1∶10的起始稀释度以两倍的连续稀释度进行测试。为了进行狂犬病病毒交叉中和，按照与前述相同的方法，用I、II和III类狂犬病病毒的代表替换试验病毒。具体地，测试血清中针对EBLV-1的交叉中和VNA的存在(系统群I；FLI-ID 7467；GenBank: DQ522866.1)、DUVV(phylogroup I；FLI-ID 12863；GenBank: EU293119)、LBV(系统群II；FLI-ID 12859；GenBank: LN849915.1)和LLEBV(系统群III，FLI-ID 40299，GenBank: NC_031955.1)。为了避免细胞适应，试验病毒在小鼠成神经细胞瘤细胞(NA 42/13)上繁殖，传代不超过三次。对于种系群I型狂犬病病毒，将校准的世卫组织国际标准免疫球蛋白(第二代人狂犬病免疫球蛋白制剂，英国Potters Bar国家标准和控制研究所)调整至0.5 (CVS-11)、1.5 (EBLV-1)和5.0 (DUVV)国际单位(IU)作为阳性对照，同时该阳性标准不被种系群II和III型狂犬病病毒中和。在所有试验中，初始血清用作阴性对照。终点VNA滴度通过使用非线性回归拟合s形函数来计算，如在R studio (R Core Team R 2020)中实施的，随后使用0.5 IU/ml的值作为血清阳性的临界值，将其转换为以IU/ml表示的浓度。

RABV-G结合IgG和IgM的ELISA

通过酶联免疫吸附试验(ELISA)评估针对RABV-G的总结合。简而言之，用巴斯德毒株的100n G/孔重组RABV-G (Proteogenix，在HEK293表达系统中的定制合成)包被96孔板，并与每种血浆样品的双份8点系列稀释液一起温育，所述稀释液存在于由在PBS中稀释的5%干乳组成的封闭缓冲液中。用山羊抗猴IgG或IgM HRP缀合的第二抗体(cat# 246-GAMon/IgM(Fc)/PO和cat# 246-GAMon/IgG(Fc)/PO，Nordic MUBio)进行检测，然后与TMB底物(BioLegendcat# 421101)并用1 M的H2因此。适当时使用封闭和洗涤步骤。使用ELISA读数器在450 nm和550 nm背景校正下读取吸光度。为了与Rabipur结合，使用相同的程序，并增加了用来自雪花莲(适马)的凝集素预包被ELISA板的步骤，以允许Rabipur组分包被到板上。对于IgG，半最大有效浓度(EC50)是使用Graphpad Prism版本8基于整个稀释系列对每个样品进行计算的。对于IgM，使用1:4稀释度的原始OD值作为读数。同样的程序用于评估克隆单克隆抗体的结合。

N蛋白结合IgG的ELISA

如上文针对RABV-G所述，通过ELISA评估针对N蛋白的总结合。用100n g/孔重组N蛋白(Proteogenix，Uniprot ID: Q0PNB8)包被96孔板。使用PBS中的5%奶粉在室温下封闭平板1小时，将血浆样品的7点系列稀释液加入平板中，并在室温下再孵育2小时。如上文针对RABV-G ELISA进行二次抗体和ELISA开发。使用ELISA读数器在450 nm下读取平板，并进行570 nm背景校正。EC50使用在Graphpad Prism版本9中进行的4PL曲线拟合来计算值。

抗体半衰期估计和抗体随时间衰减的模拟

对每只动物低于最大浓度值(Cmax)的数据进行审查，并计算Cmax后的时间(TAM=Week-Tmax)。二室模型适合TAM和浓度数据。终点半衰期是从这些模型估计值中推导出来的。基于低至EC50的抗体半衰期估计，使用R进行抗体随时间衰减的模拟80.9，通过数据内插法相当于0.5 IU/mL。

血液和骨髓中抗原特异性抗体分泌细胞的检测

血液中分泌抗原特异性成浆细胞的抗原特异性抗体的存在和骨髓中浆细胞的存在通过酶联免疫斑点(ELISpot)试验直接测定，而血液中抗原特异性记忆B细胞的存在包括一个预先的附加步骤，即在体外对记忆B细胞进行4天的多克隆激活。浆细胞和记忆B细胞的产生使用冷冻的BM和PBMC样品进行评估，而新鲜分离的PBMC用于评估浆母细胞。简而言之，96孔ELISpot板(Merck/Millipore)用500 ng/孔的纯化RABV-G、抗-IgG (Jackson ImmunoResearch)(检测总IgG作为阳性对照)和卵清蛋白(Invivogen)(作为阴性对照)包被。然后将细胞重悬于R10完全培养基(RPMI (Gibco)含10% FBS、1%青霉素/链霉素和1% L-谷氨酰胺)中，装入平板并在37℃孵育过夜。然后用含0.05%吐温-20 (PBST)的磷酸盐缓冲盐水洗涤平板。使用12.5 ng/mL的生物素化抗人IgG进行检测(Jackson ImmunoResearch)。用PBS-T再次洗涤后，将平板与用PBS-T以1∶1000稀释的碱性磷酸酶(Mabtech)偶联的链霉抗生物素蛋白一起孵育。最后用BCIP/NBT (Mabtech)对平板进行显影。用AID ELISpot阅读器和6.0版的相关软件(Autoimmun Diagnostika)计数斑点。使用OVA特异性斑点计数/百万平板细胞进行背景扣除。计算出的减去背景的每百万个细胞的斑点数用作读数。

抗体亲和力

对于在第4、8和18周收集的血浆，通过ELISA测试血浆抗体在离液剂存在下保持与RABV-G结合的能力。简而言之，对于每个样品，提供固定OD的稀释因子通过从上述血浆稀释系列中预先收集的数据的插值计算。然后，在有或没有用4.8 M尿素孵育的情况下，针对RABV-G对这样的稀释液进行一式两份的测试。对于每个时间点，分别基于结合饱和前的共享最大吸光度选择目标OD值。在第4周采集的样本的OD = 1.3，在第8周和第18周采集的样本的OD = 1.8。然后将抗体亲和力表示为与未处理样品相比，尿素处理样品中剩余结合的百分比。

流式细胞术对单一抗原特异性记忆B细胞的定量和分选

将在不同时间点分离的PBMC分批解冻，并用一组荧光标记的抗体染色，以鉴定记忆B细胞(补充表2b，c和补充图.11a、b).在该群体中，狂犬病特异性细胞随后用内部制备的RABV-G探针进行额外鉴定。简而言之，重组RABV-G蛋白使用ThermoFisher fluoro reporter Mini-Biotin-XX蛋白标记试剂盒根据制造商说明进行生物素化，然后与链霉亲和素-荧光染料复合物缀合。为了提高准确性，用2种不同的荧光染料标记的RABV-G对细胞进行染色。除第18周外，所有样本均在BD LSRFortessa流式细胞仪上获得。在BD FACSAria Fusion上采集第18周的样品，以便将数据采集与同时单细胞分选结合到96孔PCR板中。使用Flowjo版本10 (Treestar)分析数据。使用在接种前样品中观察到的RABV-G探针阳性事件的百分比进行背景扣除；因为所有的动物都是狂犬病无知，这些样品中的任何阳性信号都被认为代表背景荧光。总IgG阳性记忆B细胞中减去背景的抗原特异性记忆B细胞的百分比用作读数。

单细胞PCR扩增VDJ/VJ基因，测序和克隆单克隆抗体

使用Superscript III试剂盒(Invitrogen )，按照制造商的说明，从单个RABV-G特异性分选的记忆B细胞中提取RNA，并用随机六聚体反转录成cDNA。然后使用Sundling等人先前报道的引物和程序进行单细胞巢式PCR。在第二轮PCR产物的单程测序后，通过分配给KIMDB来确定每个重链的种系V和J等位基因的使用，而轻链的种系V和J等位基因的使用通过分配给IMGT猕猴数据库来确定。将最终PCR产物克隆到人Igγ1、Igκ或Igλ表达载体中然后单克隆抗体的生产外包给GenScript。使用IgDiscover将克隆相关序列定义为具有相同的V和J等位基因、相同的HCDR3长度、HCDR3的最小80% aa同一性以及至少一个没有错配的连接的序列。

批量BCR文库制备和文库测序

如前所述，Illumina MiSeq 2 × 300 bp配对末端测序的高通量测序文库基于5引物多重PCR方法26。IgG文库制备在研究开始后第18周完成。使用RNeasy Mini Kit (Qiagen)按照制造商的说明进行RNA提取。cDNA合成、多重PCR和索引PCR步骤按照先前描述的方案进行26。使用MiSeq试剂盒v3，600循环(Illumina)按照制造商的说明进行文库合并和测序的最终样品制备。

分类群的进化关系和B细胞库分析

使用R/Bioconductor软件包scifer(1 . 0 . 0版)对来自Sanger测序的原始测序数据进行质量过滤https://doi.org/10.18129/B9.bioc.scifer)使用默认设置。使用IgDiscover比对优质序列(v 0.15.1)，如上所述，完整的VDJ氨基酸序列用于系统发育比较。首先使用MUSCLE (v 5.1)对序列进行比对然后比对的序列用于使用FastTree (2.1.11)用LG氨基酸进化模型生成最大似然系统树。使用ggtree R包绘制树。

IgG批量库测序和谱系追踪

使用IgDiscover程序执行读取处理(v. 0.15.1)使用默认设置，除了21个核苷酸的UMI长度和0次迭代。，并使用KIMDB 1.1版作为参考数据库。为了将抗原特异性Sanger序列与大量库整合，我们使用抗原特异性序列来查询大量IgG库测序以追踪它们的克隆亲缘关系。为此，我们使用了IgDiscover克隆查询和纯系型模块。我们首先使用与前面提到的相同的克隆型定义的克隆型函数来识别每个个体的抗原特异性序列中存在的克隆型。随后，我们使用了IgDiscover纯系型模块输出包含每个个体的每个克隆型的一个代表性序列，以使用克隆查询功能。每只动物的测序信息汇总，如Sanger序列计数、原始读数、筛选出的高质量序列、克隆型数和批量发现的相关序列数，见补充材料(补充表格3)。

克隆类型多样性估计

基于合并数据集的克隆大小，使用iNEXT R包计算样本覆盖内插和外推的估计值。物种丰富度估计值是使用带有iNEXT R软件包的Chao1算法计算的。该评估是在群体水平和个人水平上进行的。对于群体克隆型丰富度估计，我们合并每个群体的所有序列，并作为一个群体计算多样性外推。对于个体水平估计，去除了< 20个序列的动物。为了使测序深度标准化，将克隆大小二次取样100倍至每个个体的最低序列数。每个个体的平均值被用作估计山丘数的输入，而Chao1指数被用于绘图。

RABV-G三聚体模型

之前发表的三聚体RABV-G的3D模型(PDB: 7U9G [https://doi.org/10.2210/pdb7U9G/pdb])从蛋白质模型数据库下载并使用UCSF ChimeraX(1 . 2 . 5版)编辑。基于以前发表的表位图谱，识别并强调了模型上的抗原位点I、II和III。

克隆单克隆抗体和血浆与参考狂犬病抗体的竞争

通过ELISA评估克隆的单克隆抗体和血浆与参照狂犬病抗体的竞争。对于克隆的单克隆抗体，使用从5 μg/mL浓度开始的1:5的8点连续稀释。为了提供计算竞争的参考，使用了流感特异性阴性对照单克隆抗体。对于血浆，在第8周收集的样本用于7点4倍系列稀释。简而言之，首先将单克隆抗体或血浆加入RABV-G包被的平板中，并孵育30分钟。随后，以固定浓度(在检测开发过程中确定)添加先前已生物素化的不同参考狂犬病抗体，并再孵育1.5小时。使用链霉亲和素-HRP或中性亲和素-HRP进行检测。使用如常规ELISA所述的TMB显影板，并在450 nm读取吸光度，用550 nm或570 nm背景校正。对于单克隆抗体，通过计算与阴性对照孵育的参考狂犬病抗体的最大OD减少百分比来评估竞争。对于血浆样品，每个样品中的mAb竞争抗体的量使用各自未生物素化的mAb的标准曲线进行定量(从37.5 μg/ml开始的4倍7点稀释系列)。评估参考单克隆抗体之间的交叉竞争(补充图.12)，每种参考单克隆抗体针对每种生物素化的竞争单克隆抗体进行系列稀释(如标准曲线)。计算每个抗体-竞争者配对的曲线下面积(AUC)。基于平板空白孔(仅包含生物素化的竞争单克隆抗体)的平均值来估计非竞争单克隆抗体产生的AUC(neg AUC)。使用以下公式估计交叉竞争(此处显示了针对竞争对手单克隆抗体B测试的单克隆抗体A):(负AUC(单抗B)-AUC(单抗A))/(负AUC(单抗B)-AUC(单抗B)*100%。

统计方法

使用Kruskal-Wallis检验在单个时间点进行比较，Dunn检验作为事后检验，当检验三组之间的差异时，使用Benjamini & Hochberg(用于BCR测序数据)或Benjamini，Krieger & Yekutieli方法(所有其他比较)对假发现率的多重比较进行调整。曼恩-惠特尼U仅比较两组时使用检验。配对样本采用Wilcoxon符号秩检验。双尾的p-在比较研究组的所有统计测试中使用值。双尾Spearman相关p-值用于分析不同参数之间的相关性。由于低样本量不允许正态分布假设，因此使用了非参数检验。使用Graphpad Prism版本9.0(美国加州拉荷亚)或R for Mac OS X. A进行统计分析p-数值< 0.05被视为所有比较的显著性。

 Hellgren F， Cagigi A， Arcoverde Cerveira R， Ols S， Kern T， Lin A， Eriksson B， Dodds MG， Jasny E， Schwendt K， Freuling C， Müller T， Corcoran M， Karlsson Hedestam GB， Petsch B， Loré K. Unmodified rabies mRNA vaccine elicits high cross-neutralizing antibody titers and diverse B cell memory responses. Nat Commun. 2023 Jun 22;14(1):3713. doi: 10.1038/s41467-023-39421-5. PMID: 37349310.