人用和兽用狂犬病疫苗替代检定方法国际研讨会报告：

科学现状与未来规划

摘    要  

大多数人用和兽用狂犬病疫苗的效力检定，需要在小鼠免疫接种后使用脑内注射活狂犬病毒进行攻击实验。美国国家毒理学项目替代性毒理学方法跨部门评估中心(National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluationof Alternative Toxicological Methods，NICEATM)、替代方法验证跨部门协调委员会(Interagency Coordinating Committee on the Validation of AlternativeMethods，CCVAM)和它们的国际合作伙伴举办了一次研讨会，审查目前在狂犬病疫苗的效力试验中可能减少、限定或取代动物使用的替代方法的应用和验证现状，并确定为进一步推进替代方法的应用需要开展的研究和开发工作。研讨会与会者一致认为，在小鼠狂犬病攻击实验过程中，在进行脑内病毒注射时应采用全身麻醉，应常规采用人道终止点(humane endpoint)作为实施动物安乐死的基础。与会者推荐，在近期可优先采用一种可替代小鼠攻击实验、同时已经验证可确定效力的实验，如：可采用小鼠抗体血清中和试验。将该方法用于有佐剂的兽用狂犬病疫苗的一项国际合作研究已于近期完成。研讨会建议，体外抗原定量检测应该优先应用在人用和无佐剂兽用狂犬病疫苗的特定产品的验证中。最后，与会者建议进一步加强国际合作，加快狂犬病疫苗效力试验替代方法的开发、验证，以及监管机构的认可和实施。

1.                                     前言

为了确定替代方法的可用性和验证状态，以期在狂犬病疫苗效力检测中进一步减少、限定，并取代（3Rs）动物使用，美国国家毒理学项目替代性毒理学方法跨部门评估中心（NICEATM）和替代方法验证跨部门协调委员会（ICCVAM）举办了一次国际研讨会：“人用和兽用狂犬病疫苗替代检定方法：科学现状和未来规划”。这次研讨会是在替代检定方法国际合作伙伴组织的共同努力下组织的，包括欧盟的动物试验替代品参考实验室（EURL ECVAM）、日本的替代方法验证中心（JaCVAM）和加拿大卫生部。本次研讨会于2011年10月11-13日在美国爱荷华州Ames国家动物卫生中心举行。来自14个不同国家超过80位代表政府、工业界和学术界的科学家参加了研讨会。本次研讨会包括16个大会报告，随后是三个分组会议，主要集中在以下议题：

l         审查目前可用的替代方法的科学现状，并确定为了使正在监管测试中的方法能立即执行所必须解决的任何尚未解决的数据缺陷。

l         制定实施策略和计划，以解决这些知识和数据方面的缺陷，获得监管机构认可、达到实用化、扩大替代方法在常规的狂犬病疫苗效力测试中的应用，从而确保能持续保护人类和动物的健康。

l         结合狂犬病疫苗效力检定的体外检定方法，精确确定目前可用于评估批与批之间一致性的过程控制参数和测试方法的有效性和合法性。

l         对当前小鼠攻击检定程序的各种修改进行评估和鉴定，以减轻或避免疼痛和痛苦，减少动物的使用。

l         确定狂犬病疫苗效力检定的当前和未来综合方法的最佳方案，以尽量减少动物的使用。

在研讨会开幕式上，WilliamStokes博士（NIEHS，美国国立卫生研究院，美国）首先解释了ICCVAM是一个跨部门委员会，负责推动可以减少、限定（较少疼痛和痛苦）和取代动物试验的替代方法的验证和监管机构的认可，同时保持对人类和动物健康以及对环境的保护。ICCVAM是由15个美国联邦管理和研究机构成员组成，这些机构需要、使用、产生或发布为确保人和动物健康所必需的有关毒性、安全性和其他类型的测试信息。ICCVAM依据法规适用性对新的、已修订的替代检定方法进行技术评估，并给各机构提供正式建议。与NICEATM合作，ICCVAM和其成员机构促成超过50种替代检定方法获得监管部门认可。Stokes指出，这次研讨会是一系列专门的疫苗研讨会中的第一个，目的是进一步讨论在2010年NICEATM-ICCVAM关于疫苗效力和安全性测试替代方法国际研讨会上已经明确的优先项目。疫苗检定替代方法是NICEATM和ICCVAM目前四个最优先项目中的一个，因为有大量动物用于这类检定，还因为实验动物会经历极端的不能缓解的疼痛和痛苦。

本次研讨会的报告提供了发言者陈述中的要点，还包括对被研讨的每个关键领域的讨论总结、结论和建议。大会发言提供了关于狂犬病对公共健康和动物健康重要性的概述，当前美国和国际上人用和兽用狂犬病疫苗效力检定的监管指南，以及改进、减少和取代狂犬病疫苗效力检定替代实验的当前状态和可用性。1.1.　狂犬病– 公共卫生和动物卫生问题

Charles Rupprecht博士（CDC，USA）阐述狂犬病是一种在传统的传染病中病死率最高、急性、进行性、无法治愈的病毒性脑炎。作为一种古老而被忽视的人畜共患病，狂犬病造成了沉重的国际负担，给公共卫生、农业和生态保护都带来危害。狂犬病毒属于弹状病毒科、狂犬病毒属，除南极洲以外各大洲都有发现。由于所有哺乳动物都易感，因此有效的疾病预防和控制变得很复杂。狂犬病毒的传播通常是通过被感染宿主咬伤而发生。在全球范围内，家犬是唯一最重要的动物储存宿主，而在发达国家，野生动物种群（例如狐狸、浣熊、臭鼬、蝙蝠等）是森林型狂犬病感染的另一个储存宿主和传染源。

每年，估计超过1千5百万人在狂犬病暴露后接受狂犬病暴露后预防治疗。治疗包括多次注射狂犬病疫苗和免疫球蛋白。尽管有这一高度有效的预防方法，狂犬病每年仍然引起全世界超过70,000人的死亡。在非洲和亚洲的发展中国家，人体暴露主要发生在年幼的儿童，并且狗构成占主导地位的传染源。在美国，人狂犬病是比较少见的，每年需要使用暴露后预防的具有潜在风险的暴露有20,000至40,000，死亡病例每年1-8个。

在欧洲、日本、加拿大、美国和其他发达国家，狗和猫的强制性疫苗接种已经有效消除了这些物种中的地方性动物狂犬病。为了尽量减少人类狂犬病的暴露风险和死亡率，对狗和野生动物进行协调的大规模疫苗接种显然是最具成本效益的方式。全球消除（elimination）犬狂犬病仍然是一个现实的目标。正在进行的消除措施包括：1）推进犬和野生动物的疫苗接种计划，2）改进诊断和监测技术，3）建立鼓吹和提高知晓度的国际通信网络（例如，世界狂犬病日活动），4）供应纯净、高效价、安全、有效的疫苗。

Cristina Cassetti博士（NIAID，USA）概述了当前由国立过敏和传染病研究所（NIAID）资助,开发经改进和更廉价的狂犬病疫苗和治疗方法的研究成果。这些成果包括只需要较少剂量的减毒活疫苗，以单克隆抗体鸡尾酒疗法取代狂犬病免疫球蛋白预防暴露后的个体，以及热稳定的野生动物疫苗。NIAID也提供重要的资源，包括新出现病毒和虫媒病毒世界参考中心（WRCEVA）和生物防御和新出现感染研究资源库（BEI）。

1.2.狂犬病疫苗 - 美国和国际法规要求

几乎所有灭活人用和兽用狂犬病疫苗的常规批签发都需要用狂犬病毒毒株进行小鼠效力攻击实验，以确保最终产品是高效价的。当前的一个例外是日本用体外ELISA效力试验批签发无佐剂兽用狂犬病疫苗。对效力检定的要求在监管机构之间仅仅有轻微差异，在历史上都是基于小鼠攻击实验。因为起源于美国国立卫生研究所，故称为“NIH试验”。NIH试验使用数组小鼠，用特定批号的疫苗进行若干次连续稀释后进行免疫，然后脑内注射活狂犬病毒。在感染后第6 - 9天，用作阳性对照和那些没有得到疫苗充分保护的小鼠会出现狂犬病临床症状（例如瘫痪、麻痹、抽搐等）。在美国和欧盟，估计每年有50,000-70，000只小鼠用于狂犬病疫苗的效力检定和签发。

1.2.1.       人用狂犬病疫苗效力检定实验的要求

Robin Levis 博士（FDA，美国）回顾了当前美国人用狂犬病疫苗的效力检定要求。美国联邦法规（CFR）对人用狂犬病疫苗效力的确定没有规定具体的检定方法。文件21 CFR610.10声明：“效力试验包括体外或体内试验，或两者兼用，是针对每个产品专门设计，能够以适当的方式明确显示其效力。所有在美国许可生产人用狂犬病疫苗的厂家坚持世界卫生组织（WHO）的指导方针，效力定义为两次有效的NIH测试的几何平均数，规定效力必须显示出与临床效果的关联。效价大于2.5 IU /剂的狂犬病疫苗可确保临床效力，能使血清中和抗体的滴度至少相当于0.5 IU / ml，定义此数值标志着可获得抵御疾病和死亡的保护。美国FDA已采纳了使用较早的人道终止点指征（如瘫痪、麻痹、抽搐），只要适用，就积极鼓励实施[Robin Levis，美国FDA，个人通信]。

尽管欧洲制造商经常重复进行2次效力检定，以满足欧洲以外疫苗进口国的要求，欧洲药典（Ph. Eur）并没有规定NIH实验所需要的重复次数。较早的人道终止点的使用已被明确界定和采用。

Sunil Gairola博士（印度血清研究所）报告说，在提交稳定有效的小鼠攻击试验数据和稳定的实时动态测试参数的情况下, 印度监管当局允许疫苗生产商使用单次小鼠效力攻击实验的数据。

正如Jinho Shin博士（WHO，瑞士）所解释的，WHO指南规定，所有批准供人类使用的狂犬病疫苗定义其效力应该是两次有效的效力试验的几何平均数。为了在整个保质期维持临床的最低效力，WHO建议每一批人用狂犬病疫苗的效力基于与国际参比制剂的比较应超过2.5 IU/剂。简单地说，狂犬病疫苗的国际标准品（IS）用于在小鼠效力攻击实验和测定糖蛋白含量的体外实验中狂犬病疫苗的标准化。标准品从一批Vero细胞来源的Pitman Moore 株原液中制备，制造采用与第五批国际标准品(RAV)一样的制造程序。参照第五批国际标准品，由来自10个国家的16名参与者的一项合作研究把候选标准品的效价用国际单位表示。在用于小鼠效力攻击实验时，标定的单位含量是8 IU /安瓿（亦即8 IU / ml）。

1.2.2.  兽用狂犬病疫苗的检定要求

Donna Gatewood博士（美国农业部，美国）简要介绍了目前在美国兽用狂犬病疫苗效力检定中在按减少、限定和取代(3Rs)原则选择替代方法时，在产品特异的验证方面的要求和指南。美国农业部目前要求采用有效的NIH实验以证明所有批签发的兽用狂犬病疫苗的效力。美国农业部为一次有效的相对效力实验规定了一个必须达到的最低要求：接受最高浓度兽用狂犬病参考疫苗稀释液（VRRV）的小鼠必须至少有70％（11/16）生存，接受最低浓度兽用狂犬病参考疫苗和测试疫苗稀释液（VRRV）的小鼠至少有70％（11/16）必须死亡; 标准攻击病毒（CVS）回复滴定必须证明被注射的滴度在12-50 个LD50之间。如果初始试验未能满足最低的相对效力的测试要求，必需增加两次实验，将所有3项试验的几何平均值用于评估相对效力。来自美国和国际机构的演讲嘉宾指出，他们认识到，虽然当前狂犬病疫苗小鼠攻击试验能确保检出低效力疫苗，他们希望看到科学有效的替代方法的实施。Gatewood强调，实施任何兽用灭活疫苗体外替代方法将需要监管机构和制造商密切的伙伴关系，要考虑到检测参比盘(panels)的使用，并依赖于生产方法的一致性。

Lukas Bruckner博士（IVI，瑞士）解释了最近以血清中和试验分析（SNT）作为兽用狂犬病灭活疫苗效力检定所进行的国际实验室间的一次成功的合作研究，并建议纳入欧洲药典专著0451，以取代NIH试验。在最近的2012年4月第142届会议上，欧洲药典委员会接受SNT法用于兽用狂犬病疫苗检定。

2.    测定狂犬病疫苗效力的小鼠攻击试验

Peter Wunderli博士（NED Biosystems，美国）介绍了目前采用的小鼠狂犬病攻击实验，并提供了多方面的批判性分析。当前的小鼠攻击试验：

•每次实验使用至少120只小鼠，所有这些小鼠接受脑内活狂犬病毒注射，约50％的小鼠在安乐死之前经历无法缓解的疼痛和痛苦。

• 会产生非常不同的结果，在评估效力时可能有高达400％的差异。

• 产生大量的无效检定，一些实验室的报告达到42％。

• 对于用同样的巴斯德分离株生产的疫苗，使用非自然的传染途径（例如脑内）和疫苗接种途径（例如腹腔内），同时采用一致接受的攻击病毒株，可能导致相对效力结果的人为增加。

正如AlexanderGaydamaka博士（AHI，美国）所解释的，疫苗制造商在发展可供替代的方法上面临相当大的挑战，包括：资源的限制，大多数兽用狂犬病疫苗中佐剂的存在、可以干扰准确的抗原定量检测，以及需要法规的协调，以避免出口产品的重复检定。Holger Kost博士（诺华公司，德国）指出，对于任何提议的效力检定替代方法，认识和确保公共健康和/或产品的安全性是至关重要的。因此，许多与会者指出，在短期内，当前小鼠的攻击实验将继续在全球范围内使用。

2.1.  限定动物使用的替代方案

2.1.1.  科学现状

狂犬病疫苗的效力试验从两个方面引起动物的疼痛和痛苦。首先，在试验动物的大脑中进行活病毒悬浮液的脑内注射，其次，未受保护的动物会出现临床狂犬病。

    活狂犬病毒的脑内（IC）注射是一种侵入性和痛苦的过程。一些监管指南和出版物提供了合适的IC注射技术指导。小鼠狂犬病效力攻击试验中所做的IC注射足以引起导致小鼠早期死亡的创伤性组织损伤。因此，监管条例规定，注射5天内发生的死亡认定为非特异性的，而不属于狂犬病毒感染。经验丰富的技术人员是必不可少的，以确保效力数据库的一致性和可靠性。WHO手册和美国农业部文件SAM308提供了注射技术的一些指导，一个最佳的灭活狂犬病疫苗效力检定的实践指导由Bruckner等人提出。德国和日本一直使用着装备有套筒、提供均匀注射深度的特殊针头，是一个重大改进。

人道终止点是一次实验尽早结束的标准，以减少发生在实验过程中疼痛或痛苦持续时间和/或降低严重程度。美国和欧洲的监管机构都制定了具体政策，在对人用和兽用狂犬病疫苗进行现行的小鼠狂犬病疫苗效力攻击试验时，以非致命性的人道终止点作为实施动物安乐死的基础。瘫痪、麻痹、和/或抽搐作为狂犬病疫苗效力实验的人道终止点，因为它们已被证明能准确地预测临床狂犬病毒感染，并表明出现这些体征的动物最终将死亡。小鼠狂犬病疫苗效力攻击实验中人道终止点的早期识别和使用的详细信息和训练资料录入一个人道终止点-致死参数（HELP）组视频产品，命名为“狂犬疫苗批效力实验中人道终止点替代死亡参数”。该视频在实验室动物实验人道终止点网站上可获得，网址http://www.humane-endpoints.info/eng/，也可在NICEATM-ICCVAM主页iccvam.niehs.nih.gov.上得到。尽可能使用可用的科学有效的人道终止点是美国公共健康服务政策中关于实验动物人文关怀和使用的一项基本原则，也载入美国和欧洲联盟现行的动物福利法规。

2003年ECVAM研讨会第48号报告"灭活狂犬病疫苗质量控制的3Rs方法" 提供了一个关于小鼠攻击实验中人道终止点和用于记录临床症状进展的评分表的综述。该报告还建议，体重减少15％或更多，加上第2阶段（丧失警觉性、转圈）或第3阶段（共济失调、全身颤抖、抽搐）的神经系统表现，可据以更精确地确定“不可逆转时间点”，从而允许在出现瘫痪、麻痹、抽搐等症状之前早得多的时间点就终止一个实验。

虽然体重降低在当前任何狂犬病疫苗攻击试验的人道终止点指南中未被规范，体重下降结合早期神经系统体征（例如，缓慢的圆周运动，后肢缺乏协调）已被发现是一种早于瘫痪、麻痹、抽搐等症状出现的有用的较早的终止点。最终会出现临床狂犬病和死亡的小鼠，在注射后第4天开始体重会下降，而在注射后第6-9天则会出现显著的体重减轻（>20％）。死亡的平均时间为注射后的10.8天。这些数据支持使用体重减轻结合早期神经症状，作为提早终止实验的人道终止点。

2.1.2. 研讨会讨论

研讨会与会者认识到，狂犬病疫苗效力检定的最终目标是完全不用动物做试验。然而，人们普遍认为，如果仍然必须使用动物，则应该以尽可能人道的方式来使用，应该仅仅使用最小数量的动物，同时确保所检定的疫苗批的效力。

与会者讨论了如何减少或避免传统IC注射程序的疼痛和痛苦。兽用疫苗生产商、一个人用疫苗制造商和一个国家控制实验室（即PEI）报告了按当前检定方案使用吸入或注射麻醉剂麻醉动物的常规IC程序，对测试结果无不利影响。与会者一致同意，以此丰富的经验为基础，应大力鼓励IC注射采用全身麻醉，并应纳入到现行的方案，以及人用和兽用狂犬病疫苗监管指南。监管机构的代表指出，在实施这种替代方法时，并不要求制造商额外进行产品特异的验证研究。欧洲和美国的动物福利法律和政策都要求考虑和使用按3R原则的替代方法，因此，对于动物的任何IC程序也应始终考虑使用全身麻醉。

研讨会与会者还讨论了IC注射后使用止痛剂，作为一种可能的方法，以尽量减少或避免注射后的疼痛和痛苦，也进一步减少经历早期狂犬病临床症状动物的疼痛和痛苦。缓释镇痛药丁丙诺啡可有效地抑制啮齿类动物的痛苦长达72小时。研讨会与会者建议研究并评估在IC程序中间、临床症状出现之前或开始时镇痛剂的使用，以确定它们的使用是否会影响有效的研究结果的产生。一些与会者质疑镇痛剂是否可能掩盖用于评估非致命性终止点的临床症状。但是，镇痛剂预计不会影响到作为人道终止点的神经系统体征（如：麻痹、瘫痪、抽搐），因为这些结果来自中枢神经系统的组织损坏，而不是疼痛诱导出来的。在IC程序后多天再进行一针或多针注射的一个担忧是与处理已受感染动物相关的安全风险。

在研讨会后，美国农业部发出一个兽用生物制品（CVB）中心公告：“大力鼓励在小鼠狂犬病疫苗攻击实验脑内接种时使用全身麻醉”。CVB公告12-12号还提供了生物制品检定的人道终止点补充指南，并重述了狂犬病攻击实验中有关人道终止点的指南。最后，在动物研究和效力实验中，如果可以证明并不影响研究结果，应鼓励使用镇痛药。

研讨会与会者还讨论了活狂犬病毒攻击小鼠的两个备用的接种途径：小鼠鼻内和外周狂犬病攻击（RPC）实验。美国农业部CVB评论他们进行的一项研究，以验证为狂犬病毒感染使用的一个更安全、非侵入性的鼻腔（i.n.）攻击方法（采用全身麻醉）。如果发现是一个足够有效的替代方法（即不对检定结果产生负面影响），CVB会考虑发布实施指南。在研讨会的讨论中，监管机构的代表指出，可能不要求制造商进行额外的产品特异的验证研究。

RPC实验赋予了比NIH实验更显著的优势，其中包括：废除IC攻击；一个更自然的感染途径；通过测量疫苗的主要免疫原性增加敏感性，以及使用更成熟的小鼠和较高的病毒攻击剂量以减少差异。简单地说，RPC实验使用单剂量疫苗的肌内给药（i.m.），28天之后通过肌肉注射攻击狂犬病毒。一个单一剂量的肌内疫苗接种更能代表常规的疫苗接种方式，并已被证明比单剂量腹腔注射人用或兽用狂犬病疫苗增加对小鼠的保护。因此，除了以上所述，RPC实验赋予了狂犬病疫苗检定更多的优势。然而，RPC实验的实施可能会要求产品的具体验证。虽然研讨会参与者认为今后的工作重点应放在替换疫苗接种－攻击试验，他们建议WHO狂犬病专家委员会考虑RPC实验的验证和使用。

2.1.3.  建议

下面的指南建议在必要时进行小鼠狂犬病疫苗效力攻击实验：

•  对于还没有实施的地方，监管机构和全球标准制定组织应鼓励：

在所有人用和兽用狂犬病疫苗小鼠狂犬病攻击实验的国内和国际实验法规和指南中立即加入有关人道终止点的要求。

    所有的监管指南中应规定在小鼠的攻击过程中常规使用麻醉剂和适当的技术用以减少与IC注射活狂犬病毒相关的疼痛和痛苦。

    提供镇痛药以避免或尽量减少与IC注射狂犬病毒有关的程序后的疼痛与痛苦，然后研究确定研究结果没有受干扰。同样，应进行调查以确定提供镇痛药是否能在无保护效果的动物中避免或尽量减少与临床狂犬病发病有关的疼痛与痛苦，同时又不会干扰研究结果。

2.2. 减少动物使用的替代方案

2.2.1 .科学现状

目前各个国际监管机构用于检测灭活狂犬病疫苗效力的小鼠攻击实验方法，在几个方面都有变化，包括：疫苗稀释液的最低倍数，每一种稀释剂量组实验小鼠的最低数量，小鼠是否接受单剂或多剂量的疫苗，以及测试有效性的标准。例如，每种稀释剂量组使用的小鼠的数目当前要求的范围是从10只到18只。考虑到每次测试至少采用3个稀释度，与每组采用最低数目的小鼠相比，每组采用最高数目的小鼠可以导致多用80％的动物。

2.2.2. 研讨会讨论

研讨会与会者考虑了几种方法来减少当前小鼠效力试验的小鼠数目，包括：1）减少检定时每个稀释度所用小鼠的数量，2）减少稀释度的数目，3）限制重复检定，和4）同时检定多个批次。

由于当前小鼠攻击实验固有的误差，许多与会者表示不愿意在所有的稀释度中减少老鼠的数量。然而，某些疫苗制造商建议，在预计分别有100％或0％死亡率的赋形剂对照组、阳性对照组和疫苗稀释组，可以使用较少的小鼠。这个方案将马上提供一个机会，可以减少不同稀释度所需试验动物的数目。事实上，一家疫苗生产商已报告了在他们的实验方案中分别减少不同稀释度所使用的动物数量，而不会影响检定结果。然而，正如上文所述，小鼠攻击实验有高达42％的实验未能满足有效性标准，可能明确需要重新检定。减少稀释度的数量或每种稀释度动物的数量的努力可能导致更多无效的检定。由于无效实验和随后重复实验的增加，可能反而会增加动物的使用，因此需要评估3Rs的优点。然而，每年检定大量疫苗批的实验室，有足够的专业知识和检定经验，让他们积极追求减少小鼠和/或稀释度的数量。

在2003年灭活狂犬病疫苗3Rs方法质量控制ECVAM研讨会报告 48中，参加者建议国家监管当局调查是否可以在兽用和人用狂犬病疫苗的效力实验中引入一个单一稀释度版本的小鼠效力试验，因为它已经成功地被一个欧洲监管当局建立。然而，本次研讨会参与者并不鼓励针对实施单稀释度检定进行进一步的验证工作，因为它不能产生量化的数据，而且因为它只会产生一个通过/失败的结果，不能给出一个效力数值。此外，对没有效力数值的疫苗批的稳定性试验是很难解释的。

正如前面提到的，目前许多国家的人用狂犬病疫苗的指南要求重复测试以获得两个有效的小鼠效力试验的几何平均值。这一要求是由小鼠攻击实验的历史性质所驱使，可接受的P = 0.95的置信区间限定在25％和400％估计效力之间。Sunil Gairola 博士（印度血清研究所，印度）报告，以提交生产数据和检定的一致性为条件，监管部门依据单次检定就可发放许可，结果使用小鼠的数量减少了50％。根据从2007至2010年经相关的国家质量控制实验室进行复核（即：每批两次检定）的数据，这样单次检定的超过75批产品都证明了生产的一致性。在每个第6批产品的效力检定继续进行两次实验的条件下，监管当局对单次检定的产品都予以批准。

鼓励疫苗生产企业进行研究和/或提供历史数据来支持取消目前要求的重复检定。单次检定的认可，将减少高达50％的人用狂犬病疫苗批签发检定所需的小鼠数量。当一个单次检定被考虑认可时，也应该建立标准，如由美国农业部（USDA）提供的允许采用单次效力试验的标准。美国和欧洲的监管当局估计人用和兽用狂犬病疫苗验证检定所用的小鼠总数为每年6000至9200只。研讨会与会者建议，通过严格的生产控制，来免除监管当局进行验证实验的需要，以避免重复检定。

目前，监管当局允许在同一时间检定多批次疫苗。这就允许用单一的参考疫苗和攻击病毒的单次回复滴定（确认毒力）来进行多批次疫苗的检定，可显著减少小鼠的使用。例如，相同的阳性对照和赋形剂对照组可以为几个批次的疫苗作对照，避免了为每批疫苗设立单独对照组的需要。多个疫苗制造商证实，目前他们在进行小鼠效力攻击实验时，都是在同一时间测试多个批次的疫苗，还同时进行样品稳定性试验。

2.2.3. 建议

不鼓励狂犬病疫苗替代性单一稀释法检测进行进一步的验证工作。然而，制造商应考虑减少试验所用的稀释度的数目，只要这样做并不增加无效检定和进行复检的数量。

鼓励制造商和监管机构研究如何降低每个疫苗稀释度(特别是较高和较低的疫苗稀释度)所需要使用的小鼠的数量，对于赋形剂和阳性对照组也有同样的要求。评估批签发效力数据的生物统计分析以确定是否可以减少稀释度的数目和/或每个稀释度所需测试小鼠的数量。

人用狂犬病疫苗制造商应回顾历史检定数据，以确定是否支持省去每一批疫苗所需要的小鼠效力平行重复实验。

为了进一步减少动物的使用，制造商应在可行的情况下，使用单一的参考测试疫苗和攻击病毒的一个单一的回复滴定，在同一时间测试多个批次。

监管当局应探讨建立标准以避免各个国家在疫苗进口时额外重复进行效力实验。

3. 限定和减少方案: 血清效力测定 - 抗体定量方法

3.1. 科学现状

 血清效价方法是测定接种过疫苗的动物所产生抗体的数量，再与原始攻击模型中已知可提供保护作用的参考抗体的效价进行比较。血清学方法避免了IC注入活狂犬病毒及其相关的不可缓解的疼痛和痛苦，同时可避免未受保护的免疫接种动物和对照组动物出现临床疾病，可显著减少小鼠狂犬病攻击实验。

Lukas Bruckner博士（IVI，瑞士）提供了一个综述，概述了改良的快速荧光灶抑制试验（RFFIT，现在被称为血清中和试验，简称SNT））用于兽用狂犬病灭活疫苗的效力实验的国际合作研究的历史和现状。欧洲药品和医疗保健质量管理局（EDQM）赞助一个由10国13个实验室进行的国际合作研究，包括欧盟、加拿大和美国的实验室，旨在确认SNT的准确性和实验室间的可转移性。 SNT能够区分出在当前的攻击实验中已经确定的低效力批。血清学检测，虽然不能完全消除动物的使用，确实符合3Rs目标：对每个试验疫苗可高达10倍（8-10与～80）地减少动物的使用量，避免IC攻击方法的痛苦和疼痛。与攻击实验相比，SNT也有更好的时间效益比（3周对大于4周）。 2011年，欧洲药典专家组15次会议建议将SNT检测纳入修订的欧洲药典专论0451。研讨会与会者一致认为，该专论提供了一个重要的框架，可以由工业界用以进行为实施SNT所必需的产品特异性验证。研讨会以后，欧洲药典委员会在2012年4月批准了修订的该专论。

Elisabeth Kamphuis博士（PEI，德国）解释说，提议的用于兽用疫苗批签发的SNT是一个定性的、最多是半定量的检测，结果为通过-失败。多重稀释的SNT可以与参考品建立平行关系，可用作补充的验证方法，并且可以用来计算IU。多重稀释的SNT将可能被指定用于评估待测和参考疫苗批的稳定性、对新的标准品进行校准，并用于评价制造工艺的改变。此外，Kamphuis还描述了一种特异性的替代人用狂犬病疫苗效力试验的多重稀释SNT的研究进展，监管当局和制造商提供了材料和分析设计方面的支持。目前的开发努力都集中在鉴定和优化该方法，包括确定所用小鼠的最佳年龄、免疫接种的数目，可能使用肌内而不是腹腔内接种。监管机构可能需要有定量的数据才会接受人用狂犬病疫苗批签发鉴别检定的结果。

3.2.  研讨会讨论

在研讨会的参与者中关于SNT的具体参数和相关的变异有相当多的讨论。具体来说，较老的老鼠拥有更成熟的免疫系统，在验证研究中接种疫苗后可能比年幼的动物产生稳定得多的血清学反应。Bruckner等人1988年报告了5-7周龄大的小鼠在接种疫苗后有一致的更高的抗体反应。此外，与标准的3-4周龄小鼠相比，9-11周龄接种疫苗的小鼠的中和血清滴度的差异减少了2倍。

检测血清学反应区分合格和不合格疫苗的最优时机，被认为是在单次、非加强的免疫接种后的第14天。然而，Wunderli指出，当前可用的数据表明，免疫接种的时间延长为21-28天，而不是当前建议的14天，可以提供更准确的效力测量和/或减少相关变异。研讨会的与会者讨论了SNT的变异性并建议应考虑制备国际标准品。

研讨会的与会者普遍认为，SNT检测有一个可以接受的、标准化的方案，该方案已经经过了充分的验证，可用于评估兽用狂犬病灭活疫苗的效力。但是，也提出了关于恰当检测低效力批的测试能力的一些考虑，建议产品特异的验证应包括补充的样品(批)，这些样品已被当前小鼠攻击试验确定为低效力。为此可能需要人为地生产一些低效力疫苗。

各个制造厂商必须在获得监管部门的批准之前进行替代检定方法的产品特异的验证。从历史上看，取代现有的检测需要进行比较研究以证明两种方法之间在统计上是等价的。由于与小鼠攻击试验相关联的固有变异性，定量相关性研究表明，证明这样的等价性可能是不可能的。虽然SNT检测低效力疫苗批的能力必须得到证明，监管当局也表示，他们认识到与定量相关的问题的复杂性，他们在进行产品特异的验证时，会邀请制造商进行开诚布公的对话。监管部门还鼓励制造商考虑通过详细的标准操作程序(SOP)和过程中检测控制来证明生产条件的一致性，以此补充他们的检定验证。已有推荐的SNT产品特异验证指南。

3.3. 建议

•使用血清学方法（即疫苗接种和中和抗体的检测），而不是效力测试的攻击试验，将避免显著的疼痛和痛苦，避免关系到工作人员安全问题的动物活狂犬病毒的使用。相比攻击试验，该方法也可以显著减少动物的使用。

•基于SNT实验室间的验证研究的结果和对欧洲药典灭活兽用狂犬病疫苗专题0451中所描述的方法的认可，认为SNT已经完全标准化，可提供一个代替小鼠攻击试验的框架，。因此，提出以下的建议：

Ø        鼓励兽用狂犬病疫苗生产商与相关监管机构合作和協商，启动使用SNT血清学方法的具体产品的验证。验证应包括确定SNT是否可以识别效力不达标批，以及SNT结果与目前的攻击实验结果相关的程度。

Ø        根据欧洲药典专题0451建立的规定和指南可以促进在全球范围内实施这种方法。

Ø        兽用和人用疫苗的多个稀释度SNT的验证，应继续用于待检和参考疫苗稳定性的定量评估，用于校准新标准，并用于评估制造工艺中的变化。

Ø        在可行的情况下，特别是对于非佐剂疫苗，鼓励制造商考虑在批签发效力实验中直接改用抗原定量测试。

4. 取代动物使用的替代方案：体外抗原定量检测

4.1 科学现状

 近年来，已经开发了许多参照一个合适的参考标准品在体外定量检测疫苗中的狂犬病毒抗原的方法。研讨会与会者回顾了这些分析并且讨论了每一种方法的验证和在全球范围内实施的机遇和挑战。

狂犬病毒刺突糖蛋白（G 蛋白）是主要的狂犬病毒抗原，在动物中显示出可诱导狂犬病毒中和抗体。狂犬病毒G蛋白的天然折叠形式是与病毒颗粒相联的三聚体形式且有高度的免疫原性。因此，能将糖蛋白含量等价于疫苗效力的任何体外试验和相关的检测用单克隆抗体，必须能够区分出两种构型的G蛋白：高免疫原性、与病毒颗粒相联的三聚体和低免疫原性、不与病毒颗粒相联或可溶的单体。建立抗原数量和质量与其免疫原性和保护性应答之间的直接关联，是一个重大和持久的问题。此外，当把含有佐剂的狂犬病疫苗效力测试包括在内时，这一障碍意味着更大的挑战。迄今为止，使用单克隆抗体（国家兽医分析实验室，NVAL单克隆抗体 ）给三聚体形式的G蛋白抗原定量的ELISA， 仅在日本用于无佐剂兽用狂犬病疫苗生产和检测的批签发效力实验(Koichiro Gamoh，NVAL（日本）。

Claudia Lopez-Yomayuza博士（Justus Liebig大学，德国）总结了可用的替代狂犬病疫苗效力检测的体外实验方法的开发，其中包括：疫苗的基因组学和蛋白质组学鉴定，抗原/免疫原含量的测量，抗原结构和病毒颗粒的完整性评估。需要注意的是G蛋白质量不与免疫原性或效力直接相关。因此，G蛋白ELISA需要中和性单克隆抗体，该抗体能正确地确定存在于疫苗批中的相关抗原（与病毒颗粒相关联的三聚体）的数量。Lopez-Yomayuza建议，提议中的体外实验应与针对目标物种的血清学试验相关联。

研讨会期间考虑了三种用于确定灭活狂犬病疫苗效力的体外替代实验类型：酶联免疫吸附试验（ELISA）、单向辐射免疫扩散试验（SRID）和抗体结合试验（ABT）。

4.1.1．酶联免疫吸附试验（ELISA）

免疫捕获ELISA（IC-ELISA）使用抗糖蛋白抗体（单克隆或多克隆）包被的的微量滴定板捕获疫苗或生产过程中所取样品中的抗原。使用G蛋白三聚体构象特异性单克隆抗体检测结合的抗原，从而仅定量构象正确的抗原。

Koichiro Gamoh博士（NVAL，日本）提供了一个IC-ELISA的综述和详细的步骤，自1996年以来该方法在日本已被批准用于无佐剂兽用狂犬病疫苗的批签发效力实验。这种替代方法在进行ELISA之前通过凝胶过滤除去水溶性单体G蛋白。使用的单克隆抗体（单克隆抗体13-10）与天然的三聚体糖蛋白结合，而不与可溶性单体G蛋白结合。正如Gamoh 强调，日本还没有要将此ELISA法应用到人用狂犬病疫苗批签发效力实验的打算。

据Jean-MichelChapsal博士（赛诺菲巴斯德，法国）介绍，目前法国国家药品安全局（其前身为法国健康产品医疗安全局（AFSSAPS）基于一种D1单克隆抗体用夹心ELISA法捕获和检测抗原。D1单克隆抗体与三聚体G蛋白而不与可溶性单体G蛋白起反应。目前在法国ELISA用于无佐剂人用狂犬病疫苗中G蛋白的定量。与狂犬病疫苗效力相关的一个主要方面是对跨膜G蛋白的中和抗体的诱导，免疫原性是取决于其保留的三维立体结构。因此Chapsal表示，在疫苗的开发过程中物理化学测试，其中包括微量量热法、表面等离子体共振、和动态光散射，可以用于了解一种疫苗的特征，特别是为了确保G蛋白保持正确的折叠结构。Chapsal也报告了用某种抗体包被和D1单克隆抗体检测的一种夹心ELISA的研发。滴定法用于针对第6届世卫组织狂犬病疫苗内部标准IU进行内部基准的校准。最后，Chapsal说，抗原定量可能代表了NIH实验的一个合适的替代，只要疫苗经过了充分的鉴定，而且制造工艺流程保持严格的一致性。

Fabrizio de Mattia博士（MSD 动物健康，荷兰）描述了柠檬酸钠处理磷酸铝佐剂兽用疫苗，用以吸附狂犬病毒抗原，然后用双抗体夹心ELISA进行定量的验证研究。测试结果表明，柠檬酸钠处理并没有改变G蛋白的抗原表位，在疫苗的抗原含量不同的情况下，检测结果均呈线性关系，并且这项技术可以区分高效力和低效力批次。

4.1.2.单向辐射免疫扩散试验（SRID）

LorraineMcElhinney 博士（AHVLA，英国）讨论了SRID实验与NIH实验的弱相关性，该实验也不能用于佐剂疫苗。发现用SRID实验检测疫苗效力值持续偏高，因为它不能区分与病毒颗粒相联的具有高度免疫原性的G蛋白病毒颗粒与其免疫原性差的单体形式。此外，采用小鼠攻击实验证明不合格的过期人用疫苗批（<2.5 IU /毫升），在用SRID法检测时却能被证明合格。最后，Lyng等1992年也证明，在稳定性研究中SRID结果与小鼠攻击实验相关性较差。因此，没有提出SRID为成品疫苗效力试验的替代品，虽然它可能会被考虑用于过程中监测以估计总的病毒蛋白。Gairola报告说，他们利用一个改良的七天SRID作为一个半成品疫苗的过程中监控。

4.1.3．抗体结合试验（ABT）

ABT 是通过连续稀释的参考品或测试疫苗批与标准化的多克隆中和抗血清孵育，并使用一种荧光灶反应检测未被吸收（中和）的抗体。正如McElhinney博士所说，即使ABT可能比小鼠攻击试验有优势，它与体内试验的相关性相当差。此外，尚无数据可证明ABT能区分天然的三聚体的G蛋白与免疫原性差的G蛋白，并且已知道佐剂的存在会抑制抗体结合从而干扰此检定。由于存在这些问题，加之已有IC-捕获ELISA检测的开发，不推荐进一步开发ABT。

Gairola博士总结了一个制造商的观点：为在狂犬病疫苗效力试验中避免使用动物，应实施和使用一致性参数和整合的方法。疫苗批签发一致性方法模式的目的是：1）确定用非动物试验可以准确检测的安全性和有效性的关键指征，从而避免在进行成品批签发检定时使用动物；2）在整个生产过程中使用质量控制程序，一旦产品一致性的关键参数有不可接受的变化，应能及时发现; 3）鼓励将更新的概念（例如，质量源于设计（QBD），过程分析技术（PAT）方法）用于疫苗质量保证(QA)。确定狂犬病疫苗效力和安全性的一致性的成功方法，将需要若干次过程中的检测以准确地确定相关狂犬病毒G蛋白的数量和完整性。这些方法可能包括2-D凝胶电泳和核蛋白的ELISA测定法，可以确定结构完整（核蛋白未能检出）的与降解的病毒颗粒（检测到释放的核蛋白）的比例。监管当局支持常规的狂犬病疫苗批签发的生产一致性参数和/或综合质量控制策略的开发和验证。

4.2. 研讨会讨论

研讨会与会者们同意，在ELISA中使用的单克隆抗体似乎是用于测量病毒相关的构象完整的糖蛋白最好的定量方法。如果可溶性G蛋白的存在会干扰免疫相关蛋白的检测，它应该被移除或被封闭（或两者都包括）。需要确定针对构象正确的G蛋白的特异性单克隆抗体与每种特定的狂犬病疫苗的保护作用的相关性。

研讨会与会者们建议，为了发展和推进狂犬病疫苗替代性体外效力检测方法，一张能标明特异性针对天然狂犬病毒G蛋白的单克隆抗体的亲和力、特性、来源和可用性的列表将是一个宝贵资源。然而，由于知识产权和注册许可方面的问题，并非所有可能有用的单克隆抗体都可用于检测方法的开发或商业治疗。研讨会与会者指出，由于狂犬病疫苗的生产来自于不同的病毒株，一种单克隆抗体可能无法适用于所有产品。

包括标准参考品在内的试剂的持续可用性是进行ELISA验证的关键。目前，EDQM和WHO狂犬病标准品都是无佐剂的，但已经与加佐剂的产品进行过比较。研讨会的与会者表示，ELISA检测法的成功开发将需要内部标准品（例如，用国际狂犬病疫苗标准品之一校准过效力的一批内部疫苗）。

研讨会与会者建议，为了使任何替代方法能成功实施并得到监管部门的批准，有必要通过使用低效力批疫苗来确定该替代方法与小鼠攻击实验能否通过之间的相关性。支持与小鼠实验结果相关联的数据，可能需要对合格的疫苗批用洗涤剂、改变pH，热处理或其他可接受的方法进行处理，来生成低效力批。，还可能需要对据认为是对人类或动物具有保护作用的血清学滴度进行比较。此外，研讨会的部分与会者建议，最低限度，在体外抗原定量效力试验实施后的规定期限，应考虑进行主动的上市后监测，以确认疫苗产生了适当的中和反应。

研讨会与会者不鼓励进一步发展ABT或SRID检测作为效力实验的替代实验，因为与小鼠攻击试验的相关性较差，并不能区分具有高免疫原性的与病毒颗粒相联的G蛋白与免疫原性较弱的单体G蛋白。 然而，研讨会与会者确实都同意，SRID分析用于在过程中检测G蛋白总量可能是有用的。

4.3．建议

l              狂犬病疫苗的效力取决于与病毒相联、构象完整的G蛋白，用能识别这样的G蛋白的单克隆抗体建立的ELISA方法看来是狂犬病疫苗效力最好的定量方法。如果可溶性的G蛋白的存在会干扰免疫相关蛋白的检测，它应该被移除或被封闭（或两者都包括）。需要确定构象正确的G蛋白特异性单克隆抗体与每个具体的狂犬病疫苗的保护作用之间的相关性。

l              鼓励生产商开发、验证和实施体外抗原定量方法，以取代小鼠攻击测试。对于无佐剂和单价的人用狂犬病疫苗（如在美国和欧盟所用的），应该优先发展体外效力试验。

l              用于成品的体外方法将需要鉴定和使用恰当的试剂（例如，单克隆抗体），这些试剂具有针对与病毒相联的三聚体形式G蛋白的中和表位的特异性。

l              体外替代试验的验证需要包括低效力批的识别。体外实验结果与血清学滴度的比较可能也是必要的。

l              狂犬病疫苗生产商目前在生产过程中使用的体外抗原定量方法包括ELISA和SRID。然而，SRID并不适用于鉴定保护性免疫所必需的特异性三聚体G蛋白。

l              实施无佐剂疫苗体外检定方法，应考虑下列准则：

2        及早并经常与监管部门沟通

2        定义试剂，包括内部病毒株有关的参考品和二级标准品

2        生成下列高质量的数据：

     - 证明单克隆抗体针对保护性的具构象表位的特异性

     - 证明区别合格和不合格批的能力

     - 比较ELISA和小鼠攻击实验

        - 最好能显示定性的而不是统计意义的相关性

2           比较小鼠或宿主动物的SNT数据

2           生成过程中的数据，以证明生产一致性

2           和监管机构一起审查数据，以确保试剂和恰当验证的相关性

2           在这个过程中尽早与国际组织协调

l         在采用佐剂疫苗体外检测方法时，考虑应用下列准则：

 制造商除考虑以上所列步骤，还应考虑下列步骤：

n          开发去除佐剂的方法：

        - 开发的数据应能确认，除去佐剂不干扰单克隆抗体检测免疫原性G蛋白。

n         开发直接测试佐剂疫苗的方法：

        - 确定被组装到成品中的G蛋白抗原的质量和数量。

n     考虑使用有佐剂的参考标准品，克服无佐剂的参考标准品和佐剂疫苗之间无平行性的问题。

5. 结论

本次国际研讨会回顾了在人用和兽用狂犬病疫苗效力检定中可以减少、限定和取代动物使用的替代方法的当前科学状态，并提出了建议，以进一步推进替代方法和途径的应用。由于有人用和兽用狂犬病疫苗领域的学术界、工业界和监管机构的代表参加，提供了良好的机会来彼此分享当前关于人用和兽用狂犬病疫苗效力试验的相似性和差异的重要见解。本次研讨会还为国际专家之间的信息交流和详细讨论提供了机会。研讨会上建立的持续的互动、沟通和合作，有望加速实施研讨会的建议和推进狂犬病疫苗试验中替代试验方法的研发、验证和实施。

关于动物福利，无论何时何地，如果仍然需要进行狂犬病毒攻击测试，研讨会参与者鼓励立即采取行动，以进一步减少或避免疼痛和痛苦。常规使用麻醉剂，处置后的镇痛药，提早的人道终止点，对缓解小鼠在此过程中所经历的严重的不可缓解的疼痛和痛苦，可以有立竿见影的效果。

研讨会的与会者也认识到，SNT效力试验已接受足够的初步验证，因此，佐剂和无佐剂疫苗的生产商应考虑产品特异性的验证。血清学方法的实施，通过避免与攻击试验有关的疼痛和痛苦，可以达到充分限制动物使用的目标。血清学检测也可以显著减少动物的使用。

研讨会的与会者还认定，在过去超过十年里，在日本对完全体外的狂犬病疫苗效力试验进行的验证、实施和推广使用都是成功的。因此，研讨会建议，对于无佐剂疫苗，体外IC-ELISA的产品特异性验证应该具有高优先级。另一个旨在促进实施佐剂疫苗的体外分析的优先领域是发展去除佐剂的方法，或建立一套程序可确保佐剂不会干扰免疫原性G蛋白的定量。

鼓励疫苗生产企业在整个新替代方法的开发和产品的具体验证中寻求与监管部门的合作和协调。最后，监管机构指出，疫苗生产商开发和实施生产过程中的质量控制测试方法，这对监测并确保最终产品的一致性是极其重要的。

本次研讨会的重点是如何将新科学和创新技术充分应用于兽用和人用疫苗效力试验的替代方法的开发、验证和实施。研讨会提出的建议将有望推动狂犬病疫苗效力试验的替代方法的实施，结果将既能确保人与动物疫苗的安全有效，又能通过优化和减少动物使用而有利于动物的福利。

[ Biologicals (2012), http://dx.doi.org/10.1016/j.biologicals.2012.07.005邱　松译  严家新校 ]