前阵子，小硕准备毕业前再疯狂一把，打算尝试一下第三代葡萄糖传感器（基于葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOx)的直接电子传输(direct electron transfer, DET)）。因为前三年在纳米多孔金(Nanoporous gold, NPG)上做了一些葡萄糖传感器的工作，都是基于第二代模型，如果可以在NPG上实现GOx的DET，将是对我前面工作的一大补充。

先简单介绍一下第一、二、三代葡萄糖传感器机理（如下图所示，图片来源J. Wang, Chem. Rev. 108 (2008) 814），这个分类是基于使用的电子媒介体(mediator, M)种类的不同，从而相应的酶的活性中心(GOx为flavin adenine dinucletide，FAD)与电极直接的电子传输(electron transfer, ET)路径不同。第一代电子媒介体为测试溶液中的溶氧，第二代为可以自我氧化还原的有机小分子，上述两种都有各自对应的问题。第三代酶电极传感器则不使用电子媒介体，而是建立起酶的活性中心和电极表面DET的桥梁，但GOx的活性中心深埋在厚厚的蛋白质中，跟电极的距离较大，要实现其DET是比较困难的。第三代葡萄糖传感器是非常理想的，可以做到reagent-less。

不过经过几天认真的文献调研、探索实验和跟导师探讨，我们感到一些蹊跷。虽然前面在碳纳米管、石墨烯等等纳米材料上对于GOx的DET文献报道了非常多了，但似乎这些报道里面鲜有是真正的第三代葡萄糖传感器。

前面交代了，真正的第三代葡萄糖传感器工作时是不需要电子媒介体参与的，可我发现绝大多数的文献报道中，是可以看到在-0.4至-0.5V之间的GOx的活性中心FAD的氧化还原峰不假，但检测葡萄糖时还需要在检测溶液中通入氧气（如图所示，有氧气存在时（点状线）循环伏安曲线可逆性变差（有些类似第一代葡萄糖传感器的机理2FAD+O₂→2FAD++O₂^2-），在加入葡萄糖后由于竞争关系还原峰下降了（见虚线，GOx(FAD)+glucose→GOX(FADH2)+gluconolactone），上述两个图片来自Anthony Guiseppi-Elie et al 2002 Nanotechnology 13 559）。疑惑就在这里了，检测葡萄糖时还需要氧气参与的到底还是不是真正意义上的第三代葡萄糖传感器么？

最近在Analytical Chemistry上报道的相关研究让我有拨云见日之感（Anal. Chem., 2014, 86 (1), pp 752–757），文章中写道“The voltammetric studies showed that, regardless of CHIT matrix, the GOx adsorbed on CNT yielding a pair of surface-confined current peaks at −0.48 V. The anodic peak did not increase in the presence of glucose in an O2-free solution indicating the lack of direct electron transfer (DET) between the enzymatically active GOx and CNT. The voltammetric peaks were due to the redox of enzyme cofactor flavin adenine dinucleotide (FAD), which was not the part of active enzyme. The presented data suggest that DET may not be happening for any type of GOx/CNT-based sensor.”也就是说虽然在−0.48 V看到了氧化还原峰，的确是FAD的氧化还原峰不假，但这个时候GOX已经变成apo-GOx了，FAD漏出来了所以可以看到氧化还原峰（如下图所示），apo-GOx已经丧失了对葡萄糖的感应能力。而看到的在氧气存在下对葡萄糖的信号是来源于离CNT较远的完整的GOx（机理其实是第一代的使用O2作为mediator）。作者干脆指出“The presented data suggest that DET may not be happening for any type of GOx/CNT-based sensor.”。此外，作者还对纳米材料的生物毒性表示了担忧，“The proposed analytical protocols can be also applied to study the effects of nanoparticles on proteins in assessing the health risks associated with the use of nanomaterials.”。

其实早在1994年，还在长春应化所工作的池其金老师和董绍俊院士等就已经发现了虽然在氧化处理的碳电极上观察到在负电位区间GOx的一个氧化还原峰，但GOx已经失活了。“Although the direct electrical communication between the adsorbed enzymes and the electrode has been achieved as described above, the adsorbed enzymes cannot catalyze their substrates to oxidize. This shows that the adsorbed enzymes have lost their bioactivity.”（Electrochimica Acta, Volume 39, Issue 16, November 1994, Pages 2431–2438）。

当然，真正的让人服气的第三代葡萄糖传感器的相关报道还是有的，比如J. J. Gooding等人设计的通过分子线来链接GOx的电极体系（如下图，来自Electrochemistry Communications, Volume 9, Issue 9, September 2007, Pages 2218–2223）。

对葡萄糖的检测也是在无氧环境下实现的（如下图）。不过这种设计用到的分子线应该挺贵的（自己合成的，还没商业化），传感器的灵敏度与第二代的相比还是比较低的。最后总结一下，也就是说，真正的第三代葡萄糖传感器还是可以实现的，我辈还有机会，我辈还需继续努力。