博文
油菜化学杀雄剂的计算机辅助设计
精选
||
2011年元旦前后，我校油菜组的一个博士来讨论课题，是关于油菜化学杀雄剂的设计。当年就以此为题目申请了国家自然科学基金，但是不幸被毙，项目也就一直没有开展。考虑到今后也不可能做类似的题目，现在将项目的立项依据部分放在这里，希望对相关研究的同学有所帮助。
1 化学杀雄剂的研究背景
杂种优势的利用是提高作物单产最有效的途径之一，可分为遗传型的杂种优势利用和生理型的杂种优势利用两大途径。遗传型的杂种优势利用包括细胞核雄性不育(GenicMale Sterility，GMS)、细胞质雄性不育(包含核质互作不育，CytoplasmMale Sterility，CMS)、自交不亲合不育(Self-incompatibility，SI)等类型。但是无论哪种遗传不育类型，都需要进行三系（或两系）的配套，不育亲本繁殖过程复杂，且有不育系稳定性较差、对温度等环境因素敏感、连续自交生活力衰退等缺陷(刘忠松,2001)。
生理型的杂种优势利用是指光照、温度、化学等外部因素引起的不育类型。其中，利用化学杂交剂(ChemicalHybridization Agent，CHA)诱导雄性不育杂交育种，称为化学杀雄，是生理性杂种优势利用的主要方法(陈万义,1999; Chase C D, 2010)。CHA，也称化学杀雄剂(Malesterilant)、杀配子剂(Gametocide)、花粉抑制剂(Pollensuppressant)等，是一类特殊的植物生长调节剂。在作物生殖生长的敏感时期，用CHA处理自交作物能选择性地杀伤雄配子或阻滞植物花粉发育，造成花粉生理性不育，而对雌配子无不良影响或影响甚微，从而抑制自花授粉，保证异花授粉而获取作物杂交种子。
相对于遗传型不育，利用CHA进行化学杂交育种有很多优点(Adugna A,2004; 陈知子, 2010）：①无须专门的不育系和恢复系，操作简便，更换组合、品种投入生产应用的速度快，制种成本低；②亲本选择自由，可充分利用我国丰富的种质资源，组合筛选出丰产、优质、抗病的杂交种；③即使CHA 诱导的雄性不育不彻底，以致杂种纯度不高，但其母本部分的自交种子也至少保持原来的产量而不致减产；而且，化学杀雄杂交种的后代无育性分离问题，有实现杂种优势多代利用的可能性；④可用于辅助去除遗传型不育的微粉，提高杂种纯度，提高育种效率。所以，利用CHA育种可迅速地获得具有高产、优质、抗逆、抗病等优良性状的杂交种。
CHA的研究始于20世纪50年代初期(MooreR H, 1950; Naylor A W, 1950)，主要集中在利用已知的植物生长调节剂(PlantGrowth Regulator，简称PGR)作为化学杀雄剂的研究，如马来酰肼、乙烯利、赤霉素等，但这些PGR大多去雄率低，对雌蕊育性或作物植株发育存在不良影响，多不具备实用价值(CrossJ W, 1991)。20世纪70年代以来，CHA的研究摆脱了PGR的局限，国外一些公司如Rohm&Hass、Santo、Shell、DuPont、LafargeCoppee等都开始研究开发新化合物类型CHA(陈万义,1999)，使CHA诱导作物雄性不育的效果有了很大提高，雄性不育率高于90%甚至95%，对雌蕊育性的影响趋小，施药的活性窗口越来越宽，成本也逐渐降低。目前，CHA已广泛应用于小麦、油菜、水稻、棉花等作物的育种。
化学杂交育种的关键在于CHA，而理想的CHA应满足以下几个条件(PickettA A, 1993; 于澄宇, 2009)：
1）有效性：能完全诱导雄蕊不育，对雌蕊的发育和植株生长影响小，保持雌蕊的结实能力，种子品质不下降，杀雄有效期长；
2）稳定性：药效不受温度、气候等环境因素的影响；
3）安全性：对环境无污染，对人畜无毒或低毒；
4）普适性：适应作物品种尽可能多；
5）经济性：化合物合成容易，来源广泛，价格低廉，以降低杂交种成本；
6）易用性：喷施技术简便易行，便于杂交种生产部门掌握与推广；
虽然现有化学杀雄药物种类很多，但能满足以上所有条件而大面积应用的CHA品种几乎没有，生产上对新型高效CHA的需求十分迫切，因此，国内外许多科研院所一直致力于新型CHA的研发筛选。
相对于灭杀性的杀虫剂、除草剂等商业开发比较成熟的农用化学品，CHA要在不影响雌蕊的发育以及植株生长的条件下，实现雄性不育，对CHA的选择性要求更高，开发难度更大，研究及应用进展也相对缓慢。CHA开发所面临的困难主要有两个：
一是CHA的作用机理复杂，目前还没有确切证实的CHA作用靶标蛋白的报道，因此，CHA的发现总体上只能依靠随机筛选，盲目性大，效率低。
二是目前还没有建立CHA的高通量筛选方法体系。在作用机理未知的情况下，CHA的筛选只能在活体植株上进行，并需人工授粉，观察雄性不育率和雌性可育率，每年只能进行1~2次，受到作物自身生长周期的限制。筛选如在人工气候条件下进行，费用较大。
如何借助信息学、计算生物学等技术手段，建立从CHA设计、合成到杀雄活性验证的高通量筛选体系，提高CHA的筛选效率，成为亟待解决的问题。
2油菜化学杀雄药物的国内外研究进展
油菜是世界第三大油料作物，也是生物柴油生产潜在的重要原料。我国是世界上最大的油菜生产国，其战略价值不言而喻。研究和生产实践表明，油菜具有明显的杂种优势，一般可增产20%～30%，好的组合增产幅度可达50%，因而，油菜杂种优势利用的研究得到了高度的重视(傅廷栋,1995)。
由于化学杂交制种的杂种优势显著，近年来CHA育种受到广大油菜育种者的青睐，湖南农业大学、西南大学、四川大学、陕西省杂交油菜研究中心等单位已成功利用化学杀雄剂制种育成并推广了“湘杂油”、“渝杂”、“蜀杂”、“秦杂油”等几个系列共10多个油菜杂交种，使中国油菜杂种优势利用总体上处于国际领先水平，获得了明显的社会、经济效益(傅廷栋,1990; 陈社员, 2005; 于澄宇, 2009)。
油菜上广泛使用的CHA主要有甲基砷酸盐类(MG1,MG2,MG4)、磺酰脲除草剂类(EN、SX-1、EXP、ESP、BHL、amidosulfuron、tribenuron-methyl)、氨基磺酸类、化杀灵/定军1号、WP、KMS-1等(官春云,1993, 1997; Banga S S, 2001; Singh V, 2004; 刘绚霞, 2007; 张耀文,2003; 戚永明, 2006; 于澄宇, 2005,2009; Yu C, 2006; 严自斌, 2006; 范宝磊，2007等)。但是，现有油菜CHA诱导雄性不育不彻底，杀雄效果受气候、植株发育状况的影响，某些杀雄剂还存在残毒等问题，致使浓度小起不到杀雄作用，而浓度过大又易产生药害，即闭蕾和死蕾株、死株，能够应用于油菜大田制种的理想CHA很少。因此，筛选高效、低毒、廉价的油菜CHA很有现实意义(于澄宇,2009)。
文献报道的油菜化学杀雄剂
类型 | 化学杀雄剂CHA | 杀雄效果评价 |
|
激素类(PGA) | 乙烯利 赤霉素(赤霉酸，农药920，MG3、GA3) 2,4-D | 效果差，部分价格高； |
|
甲基砷酸盐类 | MG1(杀雄剂1号,甲基砷酸锌) | 毒性大，含有对动物有毒的砷元素，不符合环保要求；
|
|
MG2(杀雄剂2号,甲基砷酸钠) |
| ||
MG4(杀雄剂4号,杀雄剂1号与赤霉素的配合试剂) |
| ||
氯代脂肪酸类 | 二氯乙酸 茅草枯 | 不育率低、对雌蕊有药害； |
|
氨基磺酸类 | 氨基磺酸 对苯胺磺酸 二苯胺磺酸钠 | 不育率低； |
|
磺酰脲类* | 氯嘧磺隆、甲磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲基二磺隆、酰嘧磺隆、苯磺隆、氟唑磺隆、胺苯磺隆、吡嘧磺隆等等 | 于澄宇(2009)对19种磺酰脲类化合物的杀雄效果进行了研究，多数化合物可以起到杀雄效果，其中较好的是苯磺隆、酰嘧磺隆。 | |
| | |||
| | |||
| | |||
无机盐类 | NaCl MG5 | 会导致植物组织烧伤； |
|
其它 | KMS-1 (3-对氯苯基-6-甲氧基-均三嗪-2,4(1H,3H)二酮三乙醇胺盐) | 因药害严重已停止开发； |
|
EN (巨星和四硼酸钠) | 该杀雄剂效果好、成本低，是较为理想的新型油菜化学杀雄剂； |
| |
WP* (化杀灵，结构未报道) | 具有良好的杀雄效果，有着广泛的应用前景； | | |
定军一号 (结构未报道) | 杀雄效果较好，主要用于遗传型不育杂交的辅助育种； | | |
SurfExcel (合成洗洁剂，具体成分未报道) | 杀雄效果好，其它实验正在研究中； |
| |
YB、三十烷醇、LS-1、苯胼三氮唑类、草甘膦等 | 多数应用困难，风险较大； | |
*基于配体的设计时重点关注的类型
部分油菜化学杀雄剂的结构或通式
目前，关于CHA诱导油菜雄性不育分子机制的研究还鲜见报道，主要工作集中在细胞学和生化机制上(MaH, 2005; 范宝磊, 2008a, 2008b; 于澄宇, 2009)，而且有些研究结果论断不一。关于CHA诱导雄性不育机制的主要观点有：
1) 脯氨酸合成途径脯氨酸是花粉中含量最多的游离氨基酸，具有提供花药营养、促进花粉发育和花粉管伸长的作用。刘志勇(2006)研究发现经化杀灵WP诱导后的不育油菜叶片中脯氨酸含量升高，花蕾中脯氨酸含量降低，认为脯氨酸积累在叶片而不能运往花药导致不育。杀雄剂2、3可使水稻花药中脯氨酸含量下降87.2%(张金渝, 1996)，因此，一些学者认为游离脯氨酸缺乏是花粉败育的原因(Loussaert D, 2004; 陶龙兴, 2001)。
根据脯氨酸的合成途径可以设计CHA。Methanoproline是七叶树植物Aesculusparviflora 体内的天然物，具有抑制大肠杆菌和鼠伤寒沙氏菌生长的作用，但在培养基中加入脯氨酸，菌体可以恢复生长。Methanoproline的抑菌作用可能是抑制脯氨酸的合成。基于上述研究成果，Shell公司的研究人员用methanoproline及其类似物进行筛选，从而发现SC2053(津奥啉，Wong M, 1995)等化合物的CHA功能，用于小麦杂交育种。SC2053阻断了脯氨酸积累的来源，使其含量达不到花粉正常发育的要求，从而出现雄性不育。
2) 乙酰乳酸合成酶乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase，ALS，EC4.1.3.18)存在于植物的叶绿体内，是催化支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)生物合成的第一个关键酶。磺酰脲类除草剂，可抑制植物ALS的活性，导致支链氨基酸的代谢停滞，生长点细胞分裂停滞于G1、G2期，进而使植株衰亡(McCourt J A, 2006)。于澄宇等(2005,2006, 2009)试验发现EXP 等多种不同ALS抑制剂具有油菜杀雄活性，说明乙酰乳酸合成酶很可能就是这些化学杂交剂的共同作用靶标。
3) 过氧化物酶系范宝磊等(2007)研究表明，经化学杀雄剂WP和YB诱导后，油菜叶片中POD活性显著降低，SOD和CAT活性升高，而不育花蕾中SOD和CAT活性均显著降低，POD活性升高，由此可见化学杀雄剂WP和YB使油菜的活性氧代谢出现了异常，活性氧代谢失调可能是化学杀雄剂WP和YB诱导油菜雄性不育的重要原因。
此外，同工酶分析表明，与细胞质雄性不育有关的酶可能还有酯酶(EST)、细胞色素氧化酶(COD)、多酚氧化酶(PPO)、儿茶酚氧化酶(CAO)、ATP酶、脱氢酶等(陈知子,2010; 辛金霞, 2010; 范宝磊, 2007)。通过对十字花科蔬菜细胞质雄性不育系及其保持系同工酶的比较研究，可以发现细胞质雄性不育性的基因差异及遗传控制规律。在前期研究中，华中农业大学傅廷栋院士课题组已克隆到油菜的核雄性不育基因CYP704B1-homologous genes BnMs1 and BnMs2(Yi B, 2010)，该基因也有可能成为CHA设计、育性调控的良好靶标。
本项目以油菜为CHA发现的突破点，除了因为我国具有较好的油菜杂交育种的基础，还有一个重要的原因，即油菜和拟南芥属于同科植物，具有相似的生理特征。我们前期的研究表明，用测试化合物对拟南芥和油菜进行化学杀雄处理后的形态学表型和细胞学表型大致相同，两种植物的雄性不育率也具有较高的相关性(尚未发表)。这说明可以用拟南芥建立油菜CHA的初筛模型，大大降低化合物筛选的费用，缩短筛选时间，实现化合物的批量筛选。
3 课题学术思想和意义
计算机辅助药物设计(Computer-aided Molecule Design, CADD)是一门新兴的交叉学科，它以计算化学(即分子模拟，包括量子力学和分子力学)、计算生物学为理论基础，通过计算机的模拟、计算、演示，分析分子性质和行为，模拟药物分子与生物大分子相互作用的具体模式，设计或者优化药物分子，提高其选择性和作用效率，降低毒副作用(徐筱杰，2004)。
CHA的作用本质也是通过和靶标蛋白的结合，引起蛋白活性抑制或激活，导致花药发育异常。因此，可以利用CADD技术进行CHA的合理设计，一方面，基于目前已知的杀雄效果好、安全稳定CHA进行类似物设计(间接药物设计)；另一方面，从花药发育过程中选择特异性的酶作为靶标，通过分子对接进行虚拟筛选(直接药物设计)。将CADD技术用于CHA的设计、发现，可以降低CHA发现的费用，缩短开发时间，克服随机合成筛选低效的缺点，同时，新型CHA的发现也有助于CHA杀雄的分子机制研究。
计算机辅助药物设计的方法可以克服CHA发现中的盲目性，引入拟南芥初筛模型可以克服CHA发现中的通量问题，因此，以CADD为指导，将化合物设计、有机合成、杀雄活性筛选结合起来，建立CHA合理设计、发现流程的条件已经成熟。
本项目将在充分文献调研的基础上，建立油菜CHA的定量构效关系模型、药效基团模型，结合分子场叠合的方法从商品化合物库中筛选具有潜在杀雄活性的化合物；同时，以油菜花粉发育特异性的关键酶为设计靶标(YiB, 2010; Anna A D, 2009; Iniguez-Luy F L, 2011)，模建该靶标的三维结构，通过分子对接筛选、设计新型化合物，在拟南芥和油菜上进行杀雄效果的验证，力争发现结构新颖的CHA先导化合物。
本项目研究的成功开展可以为油菜CHA的发现提供新的思路，加快新型油菜杀雄剂的开发；同时，通过分子反向对接技术，从靶标数据库中预测杀雄剂的潜在作用靶标(LiuX-F, 2010)，可以指导CHA作用机理的研究，在理论和应用上均具有重要的意义。
参 考 文 献
Adugna A, Nanda G S, Singh K & Bains N S.A comparison of cytoplasmic and chemically-induced male sterility systems forhybrid seed production in wheat (Triticum aestivum L.). Euphytica. 2004. 135: 297-304.
Anna A D, Jay S, Marc M, Franck P, Michiyo M,Robert S, Birger L M, Daphne P. CYP704B1 Is a Long-Chain Fatty Acidv-Hydroxylase Essential for Sporopollenin Synthesis in Pollen of Arabidopsis.Plant Physi. 2009. 151:574-589.
Banga S S. Towards commercial hybrids inmustard (Brassica juncea(L.) Coss). Inter. Symp. on Rapeseed Sci. Apr 19-23, 2001. Wuhan, China. p35-40.
Chase C D, Ribarits A, Heberle-Bors. MaleSterility. in Plant Developmental Biology - Biotechnological Perspectives. Vol.1. 2010. Springer. New York.p437-457.
Cross J W, Ladyman J A R. Chemical AgentsThat Inhibit Pollen Development: Tools for Research. Sex Plant Reprod. 1991. 4: 235-243.
Iniguez-Luy F L, Federico M L. The Geneticsof Brassica napus. In Genetics and Genomics of the Brassicaceae. 2011. Springer. New York. p291-322.
Liu Xiaofeng, Ouyang Sisheng, Yu Biao, LiuYabo, Huang Kai, Gong Jiayu, Zheng Siyuan, Li Zhihua, Li Honglin, JiangHualiang. PharmMapper server: a web server for potential drug targetidentification using pharmacophore mapping approach. Nucleic Acids Research. 2010. 38: W609-W614.
Loussaert D. Trihalogenatedmethylsulfonamides as specific male gametocides. Sex. Plant Reprod. 2004. 16: 299-307.
Naylor A W. Observations On the Effects ofMaleie Hydrazide On the Flowering of Tobacco, Maize and cocklebur. PNAS. 1950. 36: 230-232.
Ma H. Molecular Genetic Analyses ofMicrosporogenesis and Microgametogenesis in Flowering Plants. Annu. Rev. PlantBiol. 2005. 56:393-434.
McCourt J A, Pang S S, King-Scott J, Guddat LW, Duggleby R G. Herbicide-binding sites revealed in the structure of plantacetohydroxyacid synthase. PNAS. 2006.17: 569-573.
Moore R H. Several Effects of MaleicHydrazide On Plants. Science. 1950.112: 52-53.
Pickett A A. Hybrid wheat-results andproblems. Advances in Plant Breeding No.15.Paul Parey Scientific Publishers , 1993. Berlin Hamburg. p259.
Singh V. Evaluation of Three ChemicalHybridizing Agents in Brassica Juncea L. Brassica, 2004. 6: 71-73.
Wong M, Blouet A and Guckert A. Effectivenessof SC2053 as a chemical hybridizing agent for winter wheat. Plant GrowthRegulation. 1995. 16: 243-248.
Yu C, Hu SW, He P, Sun G, Zhang C and Yu Y. Inducingmale sterility in Brassica napus L. by a sulphonylurea herbicide,tribenuron-methyl. Plant Breeding. 2006.125: 61-64.
Yi B, Zeng FQ, Lei SL, Chen YN, Yao XQ, ZhuY, Wen J, Chen JX, Ma CZ, Tu JX and Fu TD. Two duplicate CYP704B1-homologousgenes BnMs1 and BnMs2 are required for pollen exine formation and tapetaldevelopment in Brassica napus. The Plant Journal. 2010. 63: 925-938.
陈社员, 官春云, 王国槐, 李栒, 刘忠松. 双低杂交油菜新品种湘杂油6号的选育. 中国油料作物学报. 2005. 27:37-39.
陈万义. 化学杂交剂的进展. 农药. 1999. 38:1-6.
陈知子. 植物化学杀雄研究进展. 资源开发与市场. 2010. 26:143-145.
范宝磊. 新型化学杀雄剂WP和YB诱导油菜雄性不育机理初探. 华中农业大学硕士毕业论文. 2007. 湖北武汉.
范宝磊, 岳霞丽, 郑青, 孟祥昆. 化学杀雄剂对油菜叶片和花蕾中几种酶活性的影响. 湖北农业科学. 2008. 47: 406-408.
范宝磊, 岳霞丽, 张黎娜. 化学杀雄剂诱导植物雄性不育的生理生化研究进展. 铜仁学院学报.2008.10:130-134.
傅廷栋. 中国油菜杂种优势利用研究概况. 作物研究. 1990. 4:1-4.
傅廷栋. 杂交油菜的育种与利用. 武汉: 湖北科学技术出版社, 1995: 124-132.
官春云, 李栒, 王国槐, 陈社元, 袁晏松. 化学杂交剂诱导油菜雄性不育机理的研究. I. 杀雄剂 1 号对甘蓝型油菜花药毡绒层和花粉粒形成的影响. 作物学报. 1997. 23: 513-521.
官春云, 王国槐, 李栒, 田森林, 陈社元. 几种化学药物对油菜杀雄效果的研究. 作物研究. 1993. 7:13-16.
刘绚霞, 董军刚, 刘创社, 董振生, 严自斌, 高晓岚, 高崇玉. 新型化学杀雄剂EN对甘蓝型油菜的杀雄效果及其应用研究. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2007. 3581-3585.
刘志勇. 新型化学杀雄剂化杀灵WP诱导油菜雄性不育研究. 华中农业大学硕士毕业论文. 2006. 湖北武汉.
刘忠松. 植物雄性不育机理的研究及应用. 北京: 中国农业出版社. 2001. p58.
戚永明, 刘建军, 付云龙, 胡小杰, 汤勇. 新型化学杀雄剂“定军1号”在甘蓝型油菜MS制种上控制微粉的作用效果. 种子. 2006. 25:93-95.
陶龙兴, 王熹, 俞美玉, 黄效林. CM268诱导水稻雄性不育的效果及作用机理研究. 作物学报. 2001. 27:178-184.
辛金霞, 戎郁萍. 化学杂交剂在植物育种中的应用现状. 草业科学. 2010. 27: 124-131.
徐筱杰, 侯廷军, 乔学斌, 章威. 计算机辅助药物分子设计. 化学工业出版社. 2004. 北京. ISBN: 750255520X.
严自斌, 刘创社, 董军刚, 陈荣信, 刘绚霞, 高晓岚. 化学杀雄剂ESP 对甘蓝型油菜的杀雄效果研究. 西北农业学报. 2006. 15: 81-84.
于澄宇. 植物化学杂交剂的作用特征与机理. 西北农林科技大学博士毕业论文. 2009. 陕西杨凌.
于澄宇, 胡胜武, 张春宏, 俞延军, 何蓓如. 化学杂交剂EXP对油菜的杀雄效果. 作物学报. 2005. 31:1455-1459.
张耀文, 尚毅, 李永红, 李建厂, 李殿荣. 新型化学杂交剂SX-1对甘蓝型油菜CMS的作用效果研究. 西北农业学报. 2003. 12:57-61.
张金渝, 陈以峰, 梅传生, 汤日圣. 水稻化学杂交剂的筛选和杀雄的生理基础. 江苏农业学报. 1996. 12: 11-15.
由于我不是做育种方向的，不正确的地方请多包涵。
基金申请
https://blog.sciencenet.cn/blog-460432-697283.html
上一篇：Office2013不能打开Foxmail中相应格式附件的临时处理方法
下一篇：科普啊，民科啊
