RAD18是一个重要的泛素E3连接酶，在TLS和HR修复中扮演双重角色，维持基因组的完整性，在肿瘤发生过程中发挥重要作用。一方面，RAD18催化增殖细胞核抗原（PCNA）Lys164位点的单泛素化修饰，促进跨损伤DNA合成（translesion DNA synthesis，TLS）通路耐受DNA损伤；另一方面，RAD18通过识别并结合DNA双链断裂（double-strand breaks，DSB）位点处的泛素链和重组酶RAD51C，促进同源重组（homologous recombination，HR）修复。越来越多的研究表明，RAD18的表达水平与突变发生和基于DNA损伤的癌症治疗抵抗性密切相关。因此，探究RAD18功能的调节机制对于理解肿瘤发生和克服化疗耐药具有重要意义。

    除了与各种DNA修复蛋白之间的相互作用之外，RAD18的功能还依赖其蛋白翻译后修饰，如磷酸化、泛素化和SUMO化修饰（SUMOyltion）。例如，单泛素化RAD18结合自身的UBZ结构域并形成RAD18同源二聚体，防止TLS过度激活。此外，细胞周期激酶CDC7 介导的RAD18蛋白434位点丝氨酸的磷酸化修饰对于TLS聚合酶Polη募集到紫外线（UV）诱导的损伤位点至关重要。以往研究报道，O-连接的β-N-乙酰葡萄糖胺（O-linked N-acetylglucosamine，O-GlcNAc）转移酶OGT能够募集在DNA损伤位点并催化多种DNA损伤修复因子发生氧连N-乙酰葡萄糖胺修饰（O-GlcNAcylation）。然而，O-GlcNAc糖基化如何调节RAD18的TLS和HR功能尚不清楚。

    2024年5月8日， 中国科学院北京基因组研究所郭彩霞研究员、中国科学院动物研究所唐铁山研究员和首都师范大学李静教授等在Cell Death & Disease上发表了题为“RAD18 O-GlcNAcylation promotes translesion DNA synthesis and homologous recombination repair”的研究论文，太原理工大学马晓璐等为共同第一作者。该研究报道了OGT能够结合E3泛素连接酶RAD18，并催化后者在Ser130、Ser164、Thr468位点发生O-GlcNAc糖基化修饰，促进其跨损伤合成通路（TLS）和同源重组（HR）修复的功能。

    RAD18应答DNA损伤的功能依赖其到损伤染色质的招募，作者发现S130A/S164A/T468A（3A）联合突变导致RAD18到激光微辐照（laser）、喜树碱（CPT）、博来霉素（Bleomycin）和UV诱发DNA损伤位点的募集均显著降低（图1），提示RAD18蛋白的O-GlcNAc糖基化修饰可能参与调控其DNA损伤应答功能。

图1. RAD18 O-GlcNAc糖基化位点突变抑制其到DNA损伤位点的募集

  为了探究O-GlcNAc修饰对RAD18 TLS功能的调控，作者通过染色质组分分离实验发现RAD18 3A突变导致PCNA单泛素化修饰水平明显降低（图2）。

图2. RAD18的O-GlcNAc糖基化修饰促进PCNA单泛素化

    已知RAD18没有PCNA结合结构域（PIP box），它依赖接头蛋白如RPA、SIVA1、Polη、NBS1、RAD6等结合PCNA。为了揭示3A突变抑制PCNA单泛素化的分子机制，作者分别检测了RAD18与上述接头蛋白的相互作用。如图3所示，3A突变导致RAD18与Polη结合明显减弱，RAD18蛋白的O-GlcNAc修饰促进其与Polη的结合。在机制上，3A突变体与CDC7结合降低，进而抑制了RAD18 Ser434 位点磷酸化修饰，阻碍了Polη foci形成。

图3. RAD18的O-GlcNAc糖基化促进CDC7介导的RAD18 Ser434磷酸化修饰

    另一方面，与野生型RAD18相比，回转3A突变体细胞的HR修复效率明显降低、CPT敏感性增加。为了揭示O-GlcNAcylation调控RAD18参与HR功能的分子机制，作者利用GST pulldown和免疫共沉淀发现，3A突变导致RAD18与泛素链、RAD51C的结合均明显减弱（图4）。O-GlcNAcylated RAD18对于重组酶RAD51募集到DSB位点具有促进作用。

图4. RAD18与泛素链和RAD51C的结合依赖其O-GlcNAc糖基化修饰

   综述所述，该研究发现RAD18的O-GlcNAc修饰促进其在DNA损伤位点的募集，并应答UV和CPT损伤促进停滞复制叉处的PCNA发生单泛素化修饰和RAD51募集，有助于深入理解RAD18促进 TLS和HR通路的功能和调控机制（图5）；为提高化疗治疗效果提供了新的理论基础。

图5. RAD18蛋白O-GlcNAc糖基化修饰促进TLS和HR的模型

摘要： RAD18, an important ubiquitin E3 ligase, plays a dual role in translesion DNA synthesis (TLS) and homologous recombination (HR) repair. However, whether and how the regulatory mechanism of O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) modification governing RAD18 and its function during these processes remains unknown. Here, we report that human RAD18, can undergo O-GlcNAcylation at Ser130/Ser164/Thr468, which is important for optimal RAD18 accumulation at DNA damage sites. Mechanistically, abrogation of RAD18 O-GlcNAcylation limits CDC7-dependent RAD18 Ser434 phosphorylation, which in turn significantly reduces damage-induced PCNA monoubiquitination, impairs Polη focus formation and enhances UV sensitivity. Moreover, the ubiquitin and RAD51C binding ability of RAD18 at DNA double-strand breaks (DSBs) is O-GlcNAcylation-dependent. O-GlcNAcylated RAD18 promotes the binding of RAD51 to damaged DNA during HR and decreases CPT hypersensitivity. Our findings demonstrate a novel role of RAD18 O-GlcNAcylation in TLS and HR regulation, establishing a new rationale to improve chemotherapeutic treatment.

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41419-024-06700-y 

参考资料： Ma X, Fu H, Sun C, Wu W, Hou W, Zhou Z, Zheng H, Gong Y, Wu H, Qin J, Lou H, Li J, Tang TS, Guo C. RAD18 O-GlcNAcylation promotes translesion DNA synthesis and homologous recombination repair. Cell Death Dis. 2024 May 8; 15(5):321. 

doi:  https://doi.org/10.1038/s41419-024-06700-y