氢气对系统性红斑狼疮免疫表型的影响

 背景与研究目的

调节性T细胞（Treg）是维持免疫耐受的核心细胞，但系统性红斑狼疮（SLE）从疾病活动期过渡至缓解期过程中，Treg亚群的动态变化规律尚不明确。本研究旨在探究特定Treg亚群能否作为临床病情恢复的生物标志物。

 研究对象与方法

本研究纳入8名系统性红斑狼疮患者开展纵向免疫表型检测，分别采集健康对照、疾病活动、病情稳定三个阶段样本，追踪总调节性T细胞（CD3⁺CD4⁺CD25高表达CD127低表达/阴性FoxP3⁺ Treg）、天然调节性T细胞、活化型调节性T细胞的动态变化。

 结果

与既往静态“Treg数量缺陷”模型不同，本纵向分析揭示了独特的动态变化规律：FoxP3⁺调节性T细胞（尤其是天然型、活化型亚群）在疾病活动期代偿性扩增；随临床症状趋于稳定，细胞数量回落至基础水平。

 结论

调节性T细胞亚群先一过性扩增、后逐步恢复稳态的变化特征，可区分活动性炎症与稳定缓解状态，有望作为系统性红斑狼疮机体免疫成功重塑的免疫表型特征标志物。

 关键词

调节性T细胞；Treg；免疫表型分型；系统性红斑狼疮；免疫调节

 引言

系统性红斑狼疮（SLE）是高度异质性自身免疫病，核心病理特征为严重免疫紊乱、自身耐受机制破坏、多脏器受累（1）。目前临床病情监测主要依靠传统实验室指标，如抗双链DNA（抗dsDNA）抗体、补体C3、C4水平。但这类传统指标仅能反映一过性炎症状态或脏器累积损伤，难以精准体现机体深层免疫稳态真实水平，存在明显局限性（2-4）。因此，临床上难以区分“药物短期压制急性炎症”与“长期稳定的真正临床缓解”，存在关键诊断缺口。

近年来靶向细胞治疗取得突破性进展，以CD19嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法为代表，证实系统性红斑狼疮可实现无药缓解与深度免疫重塑，彻底革新了本病治疗格局（5-9）。上述临床里程碑推动研究范式转变：相比静态横断面检测，更需关注免疫细胞的长期重建过程。但各类特异性免疫亚群从急性发作到稳定静息期的时序动力学变化尚不清晰，无法客观评判机体是否实现真正免疫恢复。

在复杂免疫网络中，调节性T细胞（Treg）是维持外周耐受、减轻自身炎症组织损伤不可或缺的核心环节。若要完整阐明Treg在狼疮中的调控作用，需将其划分为功能各异的亚群：

1. 总Treg（CD3⁺CD4⁺CD25高表达CD127低表达/阴性FoxP3⁺）：整合全身抑制信号的整体调节细胞池；

2. 天然Treg（nTreg）：胸腺来源亚群，是构成基础性自身耐受的核心；

3. 活化型Treg（aTreg）：高抑制功能成熟效应亚群，遭遇急性抗原刺激后快速活化，即刻发挥免疫管控作用。

三类亚群的功能完整性与平衡状态，直接决定狼疮发病进程及缓解质量（10,11）。

效应T细胞在缓解期多呈持续性数量回升、单向恢复，与之不同，本研究提出假说：Treg细胞池呈现复杂非线性动态调控，遵循“先扩增、后回落”的变化规律。现有文献关于狼疮患者Treg比例的研究结论相互矛盾，根源在于未区分疾病不同时序阶段（7,10）。本研究提出扩增-回落模型：急性炎症阶段，天然Treg、活化型Treg代偿性增多以对抗全身炎症；待临床病情稳定后，所有Treg亚群同步收缩，回归稳态基线水平。

为验证该模型，本研究对系统性红斑狼疮患者开展纵向免疫表型监测，追踪总Treg、天然Treg、活化型Treg在健康、活动、稳定三期的变化轨迹。该动态稳态恢复特征可作为高分辨率细胞标志物，用于评估狼疮缓解程度与免疫重塑效果。

 研究对象与方法

 研究设计与受试者纳入

本纵向前瞻性研究在中国台湾台北三军总医院开展。受试者需全部满足以下纳入标准：

1. 依据2019年欧洲风湿病学会/美国风湿病学会（EULAR/ACR）系统性红斑狼疮分类标准确诊狼疮（3）；

2. 自愿签署知情同意书，能够配合至少3个月的规范随访；

3. 新发脏器受累或疾病处于活动期，需临床干预；

4. 无标准免疫抑制治疗禁忌症。

本研究前瞻性纳入8名患者，均完成两个关键时间点的系列免疫分型检测：疾病活动期、病情稳定期。为保证研究代表性，入组队列覆盖狼疮各类异质性临床表现，包括难治性皮肤狼疮、肺动脉高压、心脏受累浆膜炎、肾活检确诊狼疮肾炎、合并间质性肺病的继发性干燥综合征、急性脑血管病变、脾切除后难治性免疫性血小板减少症（ITP）。纳入多种表型旨在验证假说：无论受累脏器、病情轻重，总Treg、天然Treg、活化型Treg均会遵循统一的动态稳态恢复规律。

所有受试者均签署书面知情同意，本研究经三军总医院伦理委员会批准（伦理批号：B202105106、C202405129）。文中部分临床指标既往已有报道（12-19），但调节性T细胞亚群的纵向免疫表型分析为本研究原创内容，尚未公开发表。文中记录全部患者个体临床资料，包括用药史、疾病活动评分。

 检测时间点定义

为完整描述调节性T细胞长期动态变化，分别在疾病活动期、稳定期开展免疫分型检测。

1. 疾病活动期：启动氢气辅助强化治疗前的首次免疫采样。氢气（H₂）以往仅被视作惰性气体、选择性羟基自由基清除剂，近年被证实是具备特异性分子靶点的强效气体信号分子。最新研究发现氢气可直接靶向线粒体电子传递链复合物Ⅲ中的 Rieske铁硫蛋白（RISP），调控线粒体信号通路；同时氢气作为新型气体信号分子，可经瞬时受体电位通道C4/相关蛋白（TRPC4-TRPC4AP）通路诱发可逆性细胞内钙离子瞬时波动。上述机制提示本研究采用的氢气辅助治疗作用远超单纯抗氧化，可多通路调控免疫，促进狼疮免疫稳态重建（20,21）。

该时间点对应患者单次病情发作或脏器损伤峰值，采集疾病活动、新发脏器受累时的基础免疫图谱。因狼疮临床高度异质，采样不严格绑定固定疾病活动评分，覆盖门诊持续活动、重症住院等各类真实临床场景。

2. 病情稳定期：疾病活动期至少3个月后，经临床确认病情持续稳定时采集免疫样本。随访免疫分型间隔根据真实临床诊疗灵活调整，多以3个月为基准，结合个体病情、随访依从性微调。纵向分析选取末次确认持续稳定的随访样本作为稳定期数据，用于对比代偿性免疫活化阶段与后续稳态修复阶段。

 流式细胞免疫分型检测

采集受试者外周血单个核细胞（PBMC）进行多色流式检测。采用标准化抗体组合（CD3、CD4、CD25、FoxP3、Helios、CD45RA、CD127）分群定义各类Treg亚群。样本采集后立即处理，染色、上机检测控制在5小时内完成。使用三激光CytoFLEX流式仪采集信号，分析标志物表达水平、Treg亚群长期动态变化；所有细胞群手动设门，排除双联细胞，专用分析软件完成数据分析（22,23）。

 治疗方案

依据EULAR诊疗指南（2），所有入组患者根据自身脏器受累情况接受个体化标准基础治疗；同时在院内获批方案下全部加用氢气辅助干预（24-27）：每日服用富氢珊瑚钙胶囊170 mg。基础核心用药为羟氯喹、糖皮质激素，临床指征允许时加用改善病情抗风湿药（DMARD），基线原有治疗方案保持不变。本研究重点观察狼疮从发作至稳定全程Treg亚群的动态演变。

 统计学分析

对8名狼疮患者活动期、稳定期两组纵向免疫表型数据开展统计分析，全面检测各类免疫细胞，主要分析目标为总Treg、天然Treg、活化型Treg，同时同步统计全体T、B细胞亚群。

因样本量较小（N=8），先采用夏皮洛-威尔克检验判断数据正态性：符合正态分布的配对数据采用配对t检验；非正态配对数据采用威尔科克森符号秩检验（28,29）。

正态分布连续变量以均值±标准差表示，非正态数据以中位数（四分位距）表示；双侧检验P＜0.05定义为差异具有统计学意义。采用自身配对设计，消除狼疮患者个体基线免疫图谱差异。全部统计分析使用专业统计软件完成。

受限于仅8例小样本，常规显著性检验易高估结果可靠性，因此预先设定一致性筛选标准：8例患者中至少6例（≥75%）变化趋势一致的免疫指标，才纳入后续重点分析。

 数据可视化

绘制雷达图（蜘蛛图），直观展示三组人群9项流式免疫指标平均占比：健康对照组（HC）、疾病活动组、病情稳定组。9项指标分别为：效应辅助T细胞（CD45RA⁺KLRG1⁺）、CD4⁺T细胞（CD28⁻CD27⁺）、CD4⁺T细胞（CD28⁻CD27⁻）、效应记忆细胞毒性T细胞（CD45RA⁻KLRG1⁺）、KLRG1⁺CD8⁺T细胞、初始B细胞（CD19⁺CD27⁻IgD⁺HLA-DR⁺）、总调节性T细胞（CD3⁺CD4⁺CD25高CD127低/阴性FoxP3⁺）、天然Treg、活化型Treg。

基于Python 3.13.13版本、matplotlib极坐标模块绘图；分组配色：健康对照蓝色、活动期红色、稳定期绿色；借助numpy.linspace均匀分配9个指标轴至360°圆周。

 免疫图谱特征分析

以雷达图作为核心可视化手段，描绘健康对照、疾病活动期、稳定期三类状态下免疫图谱的演变轨迹，直观呈现狼疮免疫重塑过程中调节性免疫环路的动态稳态修复。数据分析与可视化采用Python 3.13.9，调用NumPy、SciPy、Matplotlib科学计算库。

 伦理声明

本研究获中国台湾台北三军总医院伦理委员会审批（批号C202405129、B202105106），严格遵循2013修订版《赫尔辛基宣言》及院内研究规范；所有受试者入组前均签署书面知情同意书。

 结果

本研究前瞻性纳入8名狼疮患者：男性1例，女性7例；平均年龄41.9±6.3岁（33～50岁）；病程中位数5.7年（四分位距2.4～11.1年），包含初发与长病程患者（表1）。

 表1 患者活动期、稳定期临床基线资料（N=8）

疾病活动期患者临床表现异质性极强，覆盖多种重症/难治性病变：脾切除后免疫性血小板减少症、浆膜炎合并心衰、肺动脉高压、难治性蝶形红斑、合并蛛网膜下腔出血的脑血管病变、合并间质性肺病的继发性干燥综合征。

患者基线疾病活动度差异显著，2000版系统性红斑狼疮疾病活动指数（SLEDAI-2K）1～26分，均值9.38±8.33分。经规范治疗后全部进入稳定期，整体疾病活动度显著下降（表1）：SLEDAI-2K平均分由9.38±8.33降至1.12±1.46（P=0.024），稳定期所有患者评分均＜4分。

多项血液、炎症指标同步显著改善，印证临床病情大幅缓解：血红蛋白由10.91±3.07 g/dl升至13.35±1.49 g/dl（P=0.019），慢性病性贫血得到纠正；全身炎症显著缓解，C反应蛋白（CRP）由6.64±9.82 mg/dl降至0.54±0.38 mg/dl（P=0.023）。

抗dsDNA抗体、补体C3/C4、白细胞、血小板、血沉、白蛋白、N末端脑钠肽前体（pro-BNP）等血清及血常规指标虽均向正常趋势恢复，但小样本下差异无统计学意义（表1）。

为全面刻画临床稳定过程中免疫系统长期演变，对8名患者开展多维度免疫分型，并采用预设一致性筛选标准（≥75%患者趋势一致），筛选出稳定可靠的免疫图谱特征。

与效应T细胞单向持续回升的规律不同，全部Treg亚群均呈现特征性先扩增、后回落双相动态变化；多维雷达图在全部病例中呈现统一变化趋势（图1）。活动期调节性细胞整体扩增（红色区域）；进入稳定期后，扩增的调节细胞表型同步向内收缩（绿色区域），提示全身炎症消退后代偿性免疫抑制反应同步减弱。

 图1 流式免疫指标平均占比雷达图（蜘蛛图）

雷达图展示健康对照、疾病活动、病情稳定三组人群9项流式检测免疫指标平均占比。9项指标：效应辅助T细胞（CD45RA⁺KLRG1⁺）、CD4⁺T细胞（CD28⁻CD27⁺）、CD4⁺T细胞（CD28⁻CD27⁻）、效应记忆细胞毒性T细胞（CD45RA⁻KLRG1⁺）、KLRG1⁺CD8⁺T细胞、初始B细胞（CD19⁺CD27⁻IgD⁺HLA-DR⁺）、总调节性T细胞（CD3⁺CD4⁺CD25高CD127低/阴性FoxP3⁺）、天然Treg、活化型Treg。绘图软件Python 3.13.13搭配matplotlib极坐标模块；配色：健康对照蓝色、活动期红色、稳定期绿色；numpy.linspace均匀分配9个坐标轴至360°圆周。

为定量验证该双相变化规律，追踪各Treg亚群纵向变化曲线（表2、图2）。疾病活动期为脏器损伤、炎症峰值，所有Treg亚群均出现明显代偿性扩增：

总Treg（CD3⁺CD4⁺CD25高CD127低/阴性FoxP3⁺）健康对照基线均值23.26±18.16%，活动期升至39.18±33.05%；经标准基础治疗联合辅助干预后，稳定期显著回落至12.73±20.13%（P=0.050），75%患者呈现一致下降趋势。

 表2 调节性T细胞亚群纵向动态变化

 图2 不同病程阶段调节性T细胞亚群变化轨迹

图中展示8例狼疮患者（病例1～8）健康对照、疾病活动、病情稳定三期三类Treg亚群（A总Treg、B天然Treg、C活化型Treg）细胞占比个体曲线，每条彩色曲线代表单名患者长期变化；纵轴为对应Treg亚群细胞百分比。

整体呈现典型“扩增-回落”规律：炎症活动期Treg代偿增多，临床稳定后回落至稳态基线。流式分群百分比均以对应母细胞群为分母：

1. 总Treg：FoxP3⁺细胞占CD3⁺CD4⁺CD25高CD127低/阴性母细胞群比例；

2. 天然Treg：FoxP3⁺Helios⁺细胞占CD3⁺CD4⁺CD25高细胞群比例；

3. 活化型Treg：FoxP3高表达CD45RA⁻细胞占CD3⁺CD4⁺CD25高细胞群比例。

功能最强的两类亚群“扩增-回落”特征更突出：

天然Treg健康基线均值5.60±4.79%，活动期扩增至18.46±17.73%；临床稳定后大幅回落至5.05±6.54%（P=0.050）。该亚群变化一致性最高，8例中7例（87.5%）同步下降（一致度评分6）。

活化型Treg是介导即时免疫抑制的成熟效应亚群，变化模式完全一致：健康基线5.04±5.73%，急性发作期升至11.20±19.03%；稳定期显著回落至1.64±2.17%（P=0.036，一致度评分4）。部分患者扩增幅度极高（如病例7），但非参数威尔科克森检验、趋势一致性评分证实：尽管个体变化幅度存在差异，全队列下降趋势稳定、具备统计学意义。

综合所有患者个体曲线（图2A-C）可见：即便患者基础临床表现差异极大（难治红斑、狼疮肾炎、脾切除后血小板减少等），Treg细胞池均遵循统一的稳态修复过程。耗竭效应T细胞多呈单向持续回升，与之不同，天然Treg、活化型Treg在急性期扩增后同步回落，该独特细胞特征可区分持续性活动性炎症与免疫平衡重建后的稳定缓解。

 讨论

系统性红斑狼疮临床管理的核心难点，在于区分真正长期免疫稳态（免疫重塑）与药物短期压制急性炎症（8,30,31）。传统血清标志物（抗dsDNA、补体）仅能反映宏观炎症活动，无法体现维持长期缓解所需的深层细胞重建。针对这一诊断缺口，结合靶向细胞治疗带来的研究新思路，本研究纵向追踪Treg细胞池，明确了可用于判断病情恢复的稳定细胞特征。

本研究核心结论：从疾病活动过渡至临床稳定阶段，各类特异性Treg亚群同步呈现“先扩增、后回落”动态变化。

既往横断面研究未区分疾病分期，导致关于狼疮Treg数量的报道相互矛盾，时而提示细胞缺乏、时而发现异常升高；本研究采用严格自身对照纵向设计，解开该悖论：调节性免疫网络并非持续紊乱、数量恒定缺陷，而是存在完整双相调控。总Treg、天然Treg、活化型Treg在急性炎症期显著代偿扩增；待临床病情稳定后，同步收缩回落至稳态基线。

 机制层面解读

狼疮急性期核心病理为自身耐受全面崩溃、全身广泛组织炎症（1,8,9）。本数据证实免疫系统不会被动耐受紊乱状态，而是启动强力反向调控应答：活动期天然Treg、高抑制活性活化Treg大量扩增，是机体代偿保护机制，试图遏制重度全身自身炎症、避免脏器进一步损伤。

当标准基础治疗、辅助干预有效清除致病刺激源后，大量调节细胞不再需要维持高强度抑制，Treg整体同步回落，标志致病发作得到彻底控制、机体重回耐受静息状态。

将该“扩增-回落”规律置于全身免疫重塑整体框架中解读更具临床价值：本队列同期另一项纵向分析显示，高度分化的效应记忆细胞毒性T细胞变化轨迹完全相反——活动期严重耗竭，缓解期持续扩增恢复。

值得关注的是，本队列Treg回落幅度显著：稳定期总Treg（12.73%）、活化型Treg（1.64%）占比不仅回归健康基线（23.26%、5.04%），甚至明显低于正常水平。我们认为急性期过后短期“低于基线”是多因素共同作用结果：

1. 免疫机制：急性发作期大量快速增殖的高抑制活化Treg，在炎症抗原、促炎因子清除后，易发生活化诱导细胞死亡（AICD）（5,10,32）；

2. 药物作用：强效标准化免疫抑制剂（大剂量激素、改善病情抗风湿药）全身抑制淋巴细胞增殖，短期内大量消耗高活性、快速分裂的调节细胞；

3. 氢气介导线粒体低毒兴奋效应：氢气促进线粒体LONP1蛋白降解RISP，短暂诱发线粒体-细胞核蛋白失衡，激活线粒体未折叠蛋白反应（UPRmt）（20,21）。该低毒兴奋效应表现为先应激代偿、后线粒体功能适应性增强，为急性期天然/活化Treg大幅扩增提供代谢基础；同时氢气作为新型气体信号分子，调控TRPC4-TRPC4AP通路诱发可逆钙波动、质子外流碱化胞内环境（20）。我们推测氢气可上调调节网络敏感性：发作期促进代偿性扩增，稳态修复阶段同步加速细胞回落。

因此Treg数量大幅下降并非调节功能缺陷，而是急性期过后的过渡性细胞低谷，由程序性细胞清除、药物抑制、氢气介导代谢重编程共同造成；彻底清除过度活化免疫细胞，为机体回归正常稳态奠定基础。

两类细胞池变化形成鲜明对照，构成高精度免疫稳定图谱：耗竭KLRG1⁺效应T细胞逐步恢复、重建外周免疫监视；过度活化的Treg同步收缩、解除代偿性强抑制。这套高度有序、多维度的细胞动态交互充分说明：狼疮临床缓解不只是单纯抑制炎症，而是全身免疫网络的彻底重置。

本结论与CD19 CAR-T等靶向细胞治疗前沿研究高度契合：狼疮实现长期无药深度缓解，依赖所有免疫细胞亚群完整重建。传统血清指标（抗dsDNA、C3/C4）仅能反映一过性炎症负荷、宏观病情活动，无法评估免疫稳态真实质量。

本队列临床表型高度异质（狼疮肾炎、难治性血细胞减少等），但活化型Treg同步回落趋势高度统一，提示该指标可作为判断免疫缓解稳定可靠的细胞生物标志物。动态监测该稳态修复过程，可为临床医师提供全新客观评判标准，区分药物短期掩盖炎症与机体真正免疫重塑，指导更精准的药物减量方案。

 研究局限性

1. 本研究为观察性纵向试验，未设置随机对照组；全部受试者均接受氢气辅助治疗联合个体化免疫抑制基础方案，无法单独剥离氢气对免疫的特异性作用。各类改善病情抗风湿药可独立影响T细胞动态，难以将Treg“扩增-回落”特征单一归因于氢气干预，更应视作狼疮免疫全面重建的整体规律。

 结论

本前瞻性纵向研究证实：调节性T细胞亚群的动态稳态修复，是临床表型高度异质的系统性红斑狼疮患者免疫重建统一特征。本研究突破静态横断面检测局限，证实总Treg、天然Treg、活化型Treg存在协同“扩增-回落”规律：疾病活动期代偿扩增，临床缓解后回落至稳态基线。

尽管所有患者均同步接受标准基础治疗与氢气辅助干预，但全队列变化趋势高度一致，尤其是高抑制活性活化型Treg统一回落，提示该细胞特征是该治疗体系下稳定、具备临床参考价值的生物标志物。长期追踪该动态变化，可区分药物一过性抑制效果与机体真正免疫稳态修复。

纳入此类纵向免疫图谱指标，可优化狼疮缓解质量评估，为个体化精准药物减量策略提供依据。

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