富氢珊瑚钙对消化性溃疡疾病的作用研究

引言

消化性溃疡疾病（Peptic Ulcer Disease, PUD）包括胃溃疡和十二指肠溃疡，其主要病因是幽门螺杆菌感染和非甾体抗炎药（NSAIDs）的使用，压力、某些食物及酒精等因素也会对发病产生影响。质子泵抑制剂（Proton Pump Inhibitors, PPIs）虽治疗有效，但存在不良反应，因此亟需探索替代疗法。富氢珊瑚钙（Hydrogen-Rich Coral Calcium, HRCC）是一种新型抗氧化剂，具有抗氧化和抗炎活性，但其对消化性溃疡疾病的作用尚不明确。

方法

本研究通过小鼠消化性溃疡模型探究富氢珊瑚钙的胃保护作用，采用宏观评分法评估其对溃疡的影响；通过实时定量聚合酶链反应（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR）检测肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α）、C-C趋化因子配体2（C-C Motif Chemokine Ligand 2, Ccl2）、白细胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）等促炎细胞因子的表达水平；通过蛋白质印迹法（Western Blot）检测过氧化氢酶（Catalase）、谷胱甘肽过氧化物酶-1（Glutathione Peroxidase-1, GPx）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）等抗氧化酶的表达水平。

结果

体外实验（n=6）显示，富氢珊瑚钙可减轻乙醇与盐酸诱导的溃疡严重程度；长期（7天）给予富氢珊瑚钙（n=6）可减少乙醇与盐酸诱导的溃疡形成。此外，体内实验发现，富氢珊瑚钙处理可减少小鼠胃组织中免疫细胞浸润（n=6）、降低促炎细胞因子基因表达（n=6），并提高抗氧化酶水平（n=3）。

结论

富氢珊瑚钙具有胃保护潜力，兼具抗氧化和抗炎活性，其应用或可为消化性溃疡疾病的治疗提供新的替代方案。

Wu, Hung-Tsung, et al. "The Gastroprotective Effect of Hydrogen-Rich Coral Calcium in a Mouse Model of Peptic Ulcer Disease." Drug Design, Development and Therapy (2025): 9845-9851.

引言

消化性溃疡疾病（PUD）包括胃溃疡和十二指肠溃疡，在全球范围内发病率较高。其主要病因与非甾体抗炎药的使用及饮酒密切相关[参考文献1]。尽管已知这些因素会导致胃黏膜损伤并破坏保护机制，但针对消化性溃疡疾病的治疗策略和药物选择仍较为有限。

质子泵抑制剂（PPIs）是目前治疗消化性溃疡疾病最有效的药物。然而，长期使用质子泵抑制剂会引发多种不良反应，如艰难梭菌感染、高胃泌素血症、矿物质与维生素吸收障碍、肾脏疾病、药物相关性红斑狼疮、痴呆及肺炎等[参考文献2, 参考文献3]。因此，寻找可增强或辅助长期质子泵抑制剂治疗的替代疗法或补充剂，对易复发消化性溃疡疾病患者具有重要意义。

胃肠道黏膜长期暴露于活性氧（ROS）环境中，这些活性氧主要由感染病原体、酒精及非甾体抗炎药诱导产生。长期过度的氧化应激和炎症反应是消化性溃疡疾病的两大重要危险因素。因此，科研人员已在消化性溃疡疾病模型中测试具有强效抗氧化和抗炎活性的补充剂，以评估其治疗潜力[参考文献4]。

已知氢气可清除体内自由基并减少细胞损伤[参考文献5]，目前已有多家生产商通过电解等方式向水中注入氢气，制成富含氢分子的“富氢水”。多项研究表明，糖尿病患者饮用富氢水后，血液中低密度脂蛋白胆固醇水平和氧化应激程度显著降低[参考文献6]；肝癌患者饮用富氢水后，放疗引起的食欲减退和味觉障碍明显改善，生活质量显著提高[参考文献7]。在实验小鼠中，富氢水可改善高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝[参考文献8]；针对酒精性脂肪肝，富氢水也能有效减轻实验动物中酒精诱导的脂肪肝和肝脏炎症[参考文献9]。然而，各类富氢水产品中的实际氢浓度尚不明确，这不仅为学术研究带来挑战，也使富氢水的疗效受到质疑。

为解决这一问题，科研人员开发了新型技术——利用珊瑚钙的多孔结构高效螯合氢分子，可使水中氢浓度高达14.72 ppm[参考文献10]。此外，珊瑚钙溶解度高，与胃酸接触时表面积增大，更易在肠道内被吸收[参考文献11]。另有研究表明，富氢珊瑚钙（HRCC）对酒精诱导的肝毒性和急性酒精中毒具有防护作用[参考文献12]。本团队此前研究也发现，摄入富氢珊瑚钙可通过改变肠道菌群，保护小鼠免受蛋氨酸-胆碱缺乏诱导的肝损伤[参考文献13]。尽管富氢珊瑚钙可能对人体健康有益，但其对消化性溃疡疾病的作用仍不明确。因此，本研究通过小鼠消化性溃疡模型评估富氢珊瑚钙的作用，旨在开发新的治疗方案。

材料与方法

实验动物

所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物饲养与使用指南》，并经成功大学实验动物伦理委员会批准（伦理审批号：111-255）。8周龄雄性C57BL/6小鼠购自成功大学医学院实验动物中心，饲养环境温度控制在23±2°C，湿度60±10%，光照周期为12小时光照/12小时黑暗（早7:00开灯）。

小鼠随机分为4组，每组6只：

1. 对照组（CTL组）：经灌胃给予210 mg/kg多孔珊瑚钙（溶解于3%羧甲基纤维素钠，CMC；美国密苏里州圣路易斯市Sigma-Aldrich公司）；

2. 珊瑚钙处理组（CH组）：乙醇/盐酸（HCl/EtOH）诱导胃溃疡后，灌胃给予210 mg/kg多孔珊瑚钙；

3. 低剂量富氢珊瑚钙组（LH组）：乙醇/盐酸诱导胃溃疡后，灌胃给予105 mg/kg富氢珊瑚钙；

4. 高剂量富氢珊瑚钙组（HH组）：乙醇/盐酸诱导胃溃疡后，灌胃给予210 mg/kg富氢珊瑚钙。

采用资源方程法计算最优样本量以验证研究假设[参考文献14]。

体外胃损伤模型

小鼠禁食8小时后，麻醉并处死，分离胃组织。用丝线结扎幽门与十二指肠交界处的幽门部，随后向胃内注射1 mL含不同剂量富氢珊瑚钙的生理盐水（实验组）或含多孔珊瑚钙的生理盐水（对照组）。孵育30分钟后，排空胃内液体，再向胃内注射1 mL乙醇/盐酸溶液诱导胃损伤。处理1小时后，排空胃组织，注入1 mL 1%福尔马林溶液固定组织10分钟。沿胃大弯剪开胃组织，用数码相机拍摄并测量出血性病变区域，计算损伤评分。

体内胃损伤模型

除体外模型外，为探究富氢珊瑚钙的长期作用，小鼠每日灌胃给予210 mg/kg富氢珊瑚钙或多孔珊瑚钙，30分钟后再灌胃乙醇/盐酸溶液，连续处理7天。小鼠禁食8小时后，诱导胃溃疡1小时，随后收集各组小鼠胃组织用于后续实验。

苏木精-伊红染色（HE染色）

实验结束后，取各组小鼠胃组织，用10%福尔马林固定。将组织制成5 μm厚的石蜡切片，脱蜡后用苏木精染色3-8分钟，再用伊红溶液染色1-3分钟。脱水后封片，在明场显微镜下观察。由病理医师采用盲法评估切片，从细胞轮廓、核质特征及整体形态等方面进行形态学定性分析。

蛋白质印迹分析（Western Blot）

提取胃组织蛋白质样本，与含蛋白酶抑制剂（美国密苏里州圣路易斯市Sigma-Aldrich公司）的放射免疫沉淀裂解缓冲液（RIPA裂解液；美国俄亥俄州VWR Chemical公司）混合。在4°C下以13,000 rpm离心10分钟，收集上清液，采用二辛可宁酸（BCA）蛋白定量试剂盒（中国台湾省台北市Visual Protein公司）测定蛋白质浓度。

通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，随后将其转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜（中国台湾省台北市Biomate公司）。膜在室温下用10%脱脂牛奶封闭1小时，然后与1:1000稀释的一抗（包括铜锌超氧化物歧化酶SOD1、谷胱甘肽过氧化物酶-1 GPx、过氧化氢酶Catalase，英国剑桥市Abcam公司；肌动蛋白Actin，美国马萨诸塞州比尔里卡市Millipore公司）在4°C下孵育过夜。

用TBS-T缓冲液（10 mM Tris，pH 7.6；150 mM NaCl；0.05% Tween 20）洗涤膜后，与1:5000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗在室温下孵育1小时。使用Immobilon化学发光试剂（美国马萨诸塞州Millipore公司）检测蛋白条带，并用ImageJ软件定量条带信号强度。

实时定量聚合酶链反应（qPCR）

采用实时定量聚合酶链反应检测小鼠胃组织中白细胞介素-6（Il6）、肿瘤坏死因子-α（Tnfa）、C-C趋化因子配体2（Ccl2）等炎症细胞因子的基因表达水平，内参基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gapdh），所用引物序列如下：

- Tnfa：正向引物5'-CCC TCA CTC AGA TCA TCT TCT-3'，反向引物5'-GCT ACG ACG TGG GCT ACA G-3'；

- Il6：正向引物5'-AGT TGC CTT CTT GGG ACT GA-3'，反向引物5'-TCC ACG ATT TCC CAG AGA AC-3'；

- Ccl2：正向引物5'-TCA GCC AGA TGC AGT TAA CGC-3'，反向引物5'-TCT GGA CCC ATT CCT TCT TGG-3'；

- Gapdh：正向引物5'-CTG CGA CTT CAA CAG CAA CT-3'，反向引物5'-GAG TTG GGA TAG GGC CTC TC-3'。

按照试剂盒说明书，使用GENEzol试剂（中国台湾省新北市Geneaid Biotech公司）提取各样本总RNA；采用MMLV逆转录试剂盒（美国加利福尼亚州普莱森提亚市Protech公司）将RNA逆转录为互补DNA（cDNA）；通过实时荧光定量PCR仪（StepOnePlus Real-Time PCR Detection System，美国加利福尼亚州福斯特城Applied Biosystems公司），采用2-ΔΔCt法计算目标基因的相对mRNA表达水平。

统计学分析

使用GraphPad Prism 8软件进行图表绘制和统计学分析。数据以“均值±标准误（Mean ± SEM）”表示，采用Student's t检验或单因素方差分析（One-way ANOVA），随后进行Tukey事后检验。以p < 0.05为差异具有统计学意义。

结果

富氢珊瑚钙（HRCC）可改善盐酸/乙醇诱导的小鼠胃溃疡

为探究富氢珊瑚钙对消化性溃疡疾病（PUD）的直接保护作用，我们首先采用体外胃损伤模型进行研究。如图1所示，对照组小鼠胃组织大小正常，无任何出血迹象；而灌注盐酸/乙醇（HCl/EtOH）溶液后，小鼠胃组织出现明显胃溃疡并伴随出血。低剂量富氢珊瑚钙组（LH组）和高剂量富氢珊瑚钙组（HH组）在预处理后，均能有效抑制后续盐酸/乙醇溶液诱导的溃疡形成（图1），提示富氢珊瑚钙在体内可能具有抗消化性溃疡疾病的潜力。

图1 体外实验中，摄入富氢珊瑚钙可保护胃黏膜免受盐酸/乙醇溶液损伤 向分离的胃组织内注入1 mL含210 mg/kg富氢珊瑚钙（低剂量组，ML）、420 mg/kg富氢珊瑚钙（高剂量组，MH）的生理盐水，或含珊瑚钙的盐酸/乙醇溶液（CH组）及对照组（CTL组）溶液。预处理30分钟后，排空胃内液体，重新注入盐酸/乙醇溶液处理1小时（图A、图B）。实验结束后，剖开胃组织，采用宏观损伤评分系统进行评分（图C）。每组小鼠n=6；与指定组比较，*p < 0.001。

富氢珊瑚钙可减少盐酸/乙醇诱导的小鼠胃溃疡中免疫细胞浸润及黏膜损伤

随后，我们探究了长期给予富氢珊瑚钙的体内作用。盐酸/乙醇溶液处理后，小鼠胃黏膜出现缺损，可见出血性病变、坏死及灼伤样损伤；此外，盐酸/乙醇处理组小鼠胃组织中免疫细胞浸润显著增加。经富氢珊瑚钙预处理7天后，小鼠溃疡严重程度减轻，胃黏膜完整性得以维持，同时免疫细胞浸润减少（图2）。

图2 长期摄入富氢珊瑚钙可减少盐酸/乙醇诱导的小鼠胃溃疡中免疫细胞浸润及黏膜损伤 小鼠经灌胃给予420 mg/kg富氢珊瑚钙（高剂量组，HH）或珊瑚钙（对照组，CTL）。富氢珊瑚钙预处理30分钟后，每日灌胃给予盐酸/乙醇溶液1次，连续7天（CH组）。实验结束后，收集胃组织进行苏木精-伊红（HE）染色。

长期摄入富氢珊瑚钙可降低盐酸/乙醇诱导的小鼠胃溃疡中促炎细胞因子表达

在各组中，盐酸/乙醇处理组小鼠胃组织内促炎细胞因子表达显著升高（p < 0.01）。低剂量和高剂量富氢珊瑚钙预处理组小鼠的肿瘤坏死因子-α（Tnfa，图3A）、C-C趋化因子配体2（Ccl2，图3B）及白细胞介素-6（Il6，图3C）基因表达均显著降低。在不同剂量富氢珊瑚钙处理组中，与低剂量组相比，高剂量富氢珊瑚钙组小鼠胃组织内促炎细胞因子基因表达降低更为显著（图3）。

图3 摄入富氢珊瑚钙可降低盐酸/乙醇诱导的小鼠胃溃疡中促炎细胞因子表达 小鼠经灌胃给予210 mg/kg富氢珊瑚钙（低剂量组，LH）、420 mg/kg富氢珊瑚钙（高剂量组，HH）或珊瑚钙（对照组，CTL）。富氢珊瑚钙预处理30分钟后，每日灌胃给予盐酸/乙醇溶液1次，连续7天（CH组）。实验结束后，取胃组织，通过定量聚合酶链反应（qPCR）检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α，图A）、C-C趋化因子配体2（Ccl2，图B）及白细胞介素-6（IL-6，图C）的基因表达水平。每组小鼠n=6；与指定组比较，*p < 0.05；p < 0.01；*p < 0.001。

长期摄入富氢珊瑚钙可升高盐酸/乙醇诱导的小鼠胃溃疡中胃组织抗氧化酶表达

盐酸/乙醇溶液处理后，小鼠胃组织中谷胱甘肽过氧化物酶-1（GPx，图4A）、过氧化氢酶（Catalase，图4B）及超氧化物歧化酶1（SOD1，图4C）等抗氧化酶表达显著降低。经富氢珊瑚钙预处理后，这些抗氧化酶的表达水平得以恢复；且随着富氢珊瑚钙剂量增加，其恢复效果更为显著（图4）。

图4 摄入富氢珊瑚钙可恢复盐酸/乙醇诱导的小鼠胃溃疡中胃组织抗氧化酶表达 小鼠经灌胃给予210 mg/kg富氢珊瑚钙（低剂量组，LH）、420 mg/kg富氢珊瑚钙（高剂量组，HH）或珊瑚钙（对照组，CTL）。富氢珊瑚钙预处理30分钟后，每日灌胃给予盐酸/乙醇溶液1次，连续7天（CH组）。实验结束后，取胃组织，通过蛋白质印迹法（Western Blot）检测过氧化氢酶（图A）、谷胱甘肽过氧化物酶-1（图B）及超氧化物歧化酶1（图C）的蛋白水平。每组小鼠n=3；与指定组比较，*p < 0.05；p < 0.01。

讨论

尽管已有研究证实硫化氢（H₂S）、一氧化碳（CO）、一氧化氮（NO）等气体可改善酒精及应激诱导的溃疡[参考文献15]，但气体的临床应用需借助更专业的设备。过去由于氢气应用不便，其临床价值未得到充分开发；而本研究中采用的口服胶囊形式更适合临床应用。本研究发现，富氢珊瑚钙具有胃保护作用，摄入富氢珊瑚钙可通过升高抗氧化酶水平、降低炎症细胞因子表达，从而对抗盐酸/乙醇诱导的消化性溃疡疾病。已知氢气可通过抗氧化和抗炎作用对消化性溃疡疾病产生有益效果，而富氢珊瑚钙或可进一步拓展氢医学在消化性溃疡疾病治疗中的应用范围。

目前质子泵抑制剂（PPIs）是溃疡治疗的主要药物[参考文献16]，但胃保护类补充剂仍具有未来开发潜力，尤其针对某些难治性消化性溃疡或需考虑质子泵抑制剂副作用的情况[参考文献17, 参考文献18]。除基于质子泵抑制剂的抑酸治疗外，增强胃黏膜保护机制是另一种治疗思路。既往研究发现，乳香（Pistacia lentiscus）脂肪油可通过减轻炎症反应改善啮齿动物酒精诱导的溃疡[参考文献19]；天然呫吨酮类化合物可通过调控抗氧化信号通路实现黏膜保护作用[参考文献20]；此外，硫化氢可通过促进保护性碳酸氢盐和黏液分泌，防止胃酸损伤十二指肠黏膜[参考文献21]。因此，抗炎和抗氧化是改善消化性溃疡疾病的潜在有效策略。

关于麦卢卡蜂蜜（Manuka Honey），其可通过改善谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶等氧化应激标志物水平，同时降低血液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）浓度，从而缓解酒精诱导的急性溃疡[参考文献22]。核因子κB（NFκB）家族是可诱导的转录因子，可被肿瘤坏死因子-α激活并启动转录反应；肿瘤坏死因子-α激活核因子κB后，会触发下游信号通路引发炎症反应[参考文献23]。已知氢气可通过抑制核因子κB信号通路和炎症反应，从而对抗肺损伤[参考文献24]。本研究中富氢珊瑚钙可降低肿瘤坏死因子-α表达，推测在消化性溃疡疾病小鼠模型中，富氢珊瑚钙处理也可能降低核因子κB活性。除核因子κB外，环氧合酶（COX）也可能参与富氢珊瑚钙对消化性溃疡疾病的改善作用。环氧合酶可产生前列腺素（炎症反应的关键介质），而氢气可降低环氧合酶表达并抑制炎症细胞因子（IL-6和TNF-α）[参考文献25]。然而，环氧合酶和核因子κB在富氢珊瑚钙改善消化性溃疡疾病中的具体作用仍需进一步研究证实。上述研究结果与本研究结论一致，即富氢珊瑚钙可改善盐酸/乙醇溶液诱导的急性溃疡，且鉴于其抑酸特性，富氢珊瑚钙或可作为补充剂与质子泵抑制剂协同用于消化性溃疡疾病治疗。

结论

富氢珊瑚钙可通过抗氧化和抗炎作用减少溃疡形成，且该作用随剂量增加而增强。在小鼠模型中，富氢珊瑚钙展现出良好的胃保护活性，其具体作用机制及临床应用价值仍需进一步开展机制研究和临床研究验证。