第一部分：富氢水减轻睡眠呼吸暂停模型鼠血管损伤1

第二部分：氢气预防间歇呼停血管损伤研究细节 2

第3章：间歇性缺氧对内皮功能的影响及富氢水的作用

3.1 引言

IH是睡眠呼吸暂停综合症（OSA）的主要病理特征，而OSA是最常见的与睡眠相关的呼吸障碍。已经明确，缺氧既是心血管疾病（CVDs）的触发因素也是伴随因素。然而，持续气道正压通气（CPAP）在减少OSA患者的CVDs发病率方面几乎没有显示出益处。内皮功能障碍是CVDs的初始阶段，定义为一氧化氮（NO）的生物可用性受限。在健康志愿者中，通过摄入富氢水（HRW）30分钟后，肱动脉的血流介导扩张得到改善，表明HRW可能改善人类的内皮功能。然而，该研究只调查了一次剂量HRW的急性效应。对于OSA患者多次给药的效果尚不清楚。

本章的研究旨在检验这样一个假设：IH导致内皮功能障碍，而HRW可能是除了CPAP之外的一个有前景的治疗方法，可以改善内皮功能。炎症细胞因子、氧化应激标志物、抗氧化酶表达以及衰老标志物的评估，是为了弄清楚HRW作用的机制。

3.2 结果

3.2.1 动物特征

一些动物在暴露于IH的初期表现出轻微的不适迹象（啃咬笼子和铺垫），然而，在整个研究期间没有观察到任何动物出现疾病迹象。表3.1显示了8周内动物体重的变化，图3.1展示了各组的体重增加情况。四组间的体重增加百分比无差异（图3.2）。表3.2和表3.3显示了每天和不同时间段各组消耗的水量。四组间日常水消耗量（RW和HRW）无差异（图3.3）。

表3.1：研究阶段小鼠的体重

3.2.2 缺氧增加了小鼠肾脏中HIF-1α的表达

低氧诱导因子1（HIF-1）是由HIF-1α和HIF-1β组成的异二聚体蛋白复合物，在身体对低氧浓度的反应中起着关键作用。HIF-1α是一种普遍存在的蛋白质，包含一个氧依赖性降解域，该域在正常氧条件下调节其持续降解。当低氧稳定HIF-1α时，它会转位到细胞核内，在那里与HIF-1β二聚化形成活性转录因子，并调控目标基因的表达。与暴露于间歇性空气（IA）的小鼠相比（HIF-1α/vinculin: 1.30 ± 0.21），暴露于间歇性缺氧（IH）的小鼠肾脏中的HIF-1α表达水平显著增加（HIF-1α/vinculin: 1.70 ± 0.26）（p < 0.05）（图3.4）。在IARW和IAHRW之间（P=NS），以及IHRW和IHHRW之间（P=NS）没有差异。

3.2.3 缺氧增加了暴露于IH的小鼠炎症标志物的水平

与对照组相比，暴露于间歇性缺氧（IH）的小鼠血浆中的白细胞介素6（IL-6）水平增加（FI: 49 ± 13.45 vs. 32.75 ± 7.80, p < 0.1）（图3.5 A）。此外，与对照组相比，暴露于IH的小鼠血浆中的单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）水平也增加（FI: 52.67 ± 14.57 vs. 34.25 ± 5.56, p < 0.1）（图3.5 B）。缺氧和富氢水（HRW）对白细胞介素10（IL-10）水平没有影响（p > 0.1）（图3.5 C）。

3.2.4 氢气改善了暴露于IH的小鼠内皮功能障碍

通过累加乙酰胆碱（Ach）刺激预先用PE收缩的主动脉段，以引发一氧化氮（NO）依赖性血管舒张。四组中不同浓度Ach引起的血管舒张情况如图3.6 A所示。与IARW组相比，IHRW组在Ach (10^-6)时的血管舒张功能降低（p < 0.05），而HRW具有保护作用（IHHRW vs. IHRW, p < 0.05）。最大浓度Ach (10^-5)诱导的最大松弛在IHRW组显著减弱，与其他组相比差异显著（Emax（%）: 60.70 ± 9.22%, p < 0.005）（图3.6 C）。HRW治疗改善了IH组的Emax至对照组水平（Emax（%）: 76.12 ± 5.75%比Emax（%）: 80.65 ± 1.23%，p = 0.1704）（图3.6 C）。所有组之间Ach的EC50没有显著变化（p=NS）。使用硝普钠（SNP）测量非内皮依赖性松弛，以确认松弛变化是内皮依赖性的。在四组之间未观察到SNP诱导的血管舒张有差异（p=NS）（图3.6 D）。

3.2.5 氢气减少了暴露于IH的小鼠的血管收缩

通过累加苯肾上腺素（PE）来刺激血管收缩（图3.7 A）。与IARW组相比，IHRW组在最大PE (10^-5)诱导的收缩显著增加（p < 0.05）（图3.7 C）。HRW治疗显著减弱了IH组的收缩（p < 0.05），并将其降至对照组水平（p=NS）（图3.7 C）。所有组之间PE的EC50没有显著变化（p=NS）。

3.2.6 氢气恢复了暴露于IH的小鼠的基础NO产生

基础NO产生在血管静止时维持血管舒张张力，该张力的丧失会增加静息时的血管收缩和内皮功能障碍。在四组中，分别在有无N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）的情况下获得对PE的浓度反应曲线（图3.8 A-D）。计算存在L-NAME时的曲线下面积（AUC），并将其除以不存在L-NAME时的AUC。加入L-NAME后，IARW组与IHRW组相比，PE引起的收缩反应增强（Emax（%）:218.45±25.86%比193.94±31.59%）（图3.8 A & C）。与IHRW组相比，IARW组的基础NO产生显著更高（AUC=245.23±22.51比209.15±17.18, p<0.05）（图3.8 E）。HRW治疗显著改善了IH组的基础一氧化氮产生（AUC=272.37±40.83, p<0.05）（图3.8 E）。给予HRW后，IHHRW组与IARW组之间无差异（p=0.2754）（图3.8 E）。

3.2.7 氢气降低了暴露于IH的小鼠中ADMA的水平

非对称二甲基精氨酸（ADMA）是内皮一氧化氮合酶（eNOS）的内源性抑制剂，通过与L-精氨酸竞争来损害NO的产生，从而导致内皮功能障碍，进而引发动脉粥样硬化。与对照组相比，暴露于IH的小鼠的血浆ADMA水平显著升高（0.91 ± 0.04μM/L比0.83 ± 0.02μM/L, p < 0.001）（图3.9），而HRW治疗有效降低了ADMA水平（0.74 ± 0.07μM/L, p < 0.001）（图3.9）。

3.2.8 氢气降低了暴露于间歇性缺氧的小鼠的全身氧化应激

与对照组相比，暴露于IH的小鼠尿液中8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OHdG）的水平显著升高，这是一种DNA损伤的氧化应激标志物（5.59 ± 0.68比3.58 ± 0.54 μg/ml, p < 0.01）（图3.10 A）。HRW降低了暴露于IH的小鼠的8-OHdG水平（4.45 ± 1.17 μg/ml, p < 0.1）（图3.10 A）。生活在常氧条件下的小鼠饮用HRW后，尿液中的8-OHdG水平也有所增加（4.70 ± 0.36 μg/ml, p < 0.05）（图3.10 A）。此外，与对照组相比，暴露于IH的小鼠血浆中的8-异前列腺素水平显著升高，这是脂质过氧化的氧化标志物（214.65 ± 38.42比96.53 ± 78.5 pg/ml, p< 0.001）（图3.10 B）。HRW有效地降低了暴露于IH的小鼠的8-异前列腺素水平（130.06 ± 38.42 pg/ml, p < 0.01）（图3.10 B）。

3.2.9 IH和HRW处理动物中抗氧化酶的表达

超氧化物歧化酶（SOD）催化超氧化物（O2 -）转化为氧气和过氧化氢（H2O2），在对抗氧化应激的抗氧化防御中发挥重要作用。哺乳动物中存在三种形式的SOD：胞质超氧化物歧化酶（SOD1）、线粒体超氧化物歧化酶（SOD2）和细胞外超氧化物歧化酶（SOD3）。我们观察到IH组中的SOD2水平下降（图3.11）。有趣的是，我们发现HRW处理组中的SOD2水平进一步下降（图3.11）。谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX-1）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX-4）是谷胱甘肽过氧化物酶家族的成员，参与脂质过氧化物的解毒。GPX-1降解过氧化氢、烷基过氧化物和脂肪酸氢过氧化物，而Gpx4能降解脂蛋白和复合脂质中的氢过氧化物。暴露于IH的动物中GPX-4的表达降低，并在HRW处理后得到改善（图3.11）。四组之间未观察到GPX-1的差异（图3.11）。

3.2.10 IH和HRW处理动物中炎症因子的表达

在IHRW组中，我们记录到IL-6的表达增加，而在IHHRW组中IL-6的表达略有下降（图3.12），这与血浆中炎症因子的测量结果相似（图3.5A）。动物和人类研究已经确定了OSA与肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平升高之间的显著关联。与IARW组相比，IHRW组中的TNF-α水平升高（图3.12）。HRW降低了IA和IH组中与RW处理组相比的TNF-α水平，但没有观察到统计学意义（图3.12）。

3.2.11 IH和HRW处理动物中的衰老标志物

细胞衰老的两个主要特征途径是p16-pRB和p53-p21。在四组中测量了肾脏中的p16和p21的表达。与IARW相比，IHRW中的p16表达增加，而与IHRW相比，IHHRW中的p16表达减少（图3.13）。四组中的p21水平没有差异（图3.13）。

第3章 总结

实验组动物中HIF-α水平的升高证实了它们确实暴露于缺氧环境中，表明IH模型建立成功。IH动物血液中的炎症因子和氧化应激标志物增加。IH还导致内皮功能障碍，表现为乙酰胆碱诱导的血管舒张受损、PE引起的血管收缩增加、基础NO产生减少以及ADMA水平升高。HRW在改善氧化应激和内皮功能障碍方面显示出益处。此外，HRW影响抗氧化酶的表达，并减轻了由缺氧引起的加速衰老过程。