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氢气生物医学未来展望（英国博士论文9）
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第九章 未来展望 英国博士论文
9.1 氢气在健康领域的应用
如第一章第1.2节所述，美国食品和药物管理局（FDA）将氢气分类为一般认为安全（GRAS）的产品（2014年），并在欧洲联盟（EU Commission Regulation, 2011）和英国（Food Standards Agency, 2018）的法规1129/2011部分C组I下被视为食品补充剂（E949）。然而，为了更深入地理解氢气如何在分子水平上启动抗氧化和细胞保护特性，有必要阐明氢气相互作用的主要目标或多个目标。对临床和实验室数据的分析表明，仅仅清除活性氧（ROS）和活性氮（RNS）并不能完全解释氢气在细胞和体系统中减轻ROS/RNS的程度。这里呈现的证据表明，氢气不太可能直接减少大量•OH或ONOO-（参见第四章第4.2.1和4.2.2节）。尽管如此，氢气可能通过以下途径阻止O₂还原为超氧阴离子：i) 保持结构完整性，可能是稳定蛋白质内的口袋结构（Chen等人，2019c；Hancock等人，2022），ii) 通过二氢键或Kubas键与Fe^2+辅因子结合，防止不可逆氧化（Kim等人，2022），或iii) 通过直接或间接与信号分子如Ca^2+（见第四章第4.4.1节）和/或PO_2^-（见第四章第4.4.2节）的相互作用。
开创性研究表明，氢气可以减少由外科手术干预（例如缺血再灌注）、伤害或疾病引起的氧化损伤（Gharib等人，2001；Fukuda等人，2007；Tarnava，2021）。然而，这是否是由于氢气的直接还原潜力，还是由于ROS和RNS生成的上游作用，尚未在体内得到明确表征，需要进一步的分子研究。
9.2 更广泛的研究
除了本文探讨的氢气的健康益处外，大量的学术研究还发现，在发芽、种植和生长阶段暴露植物于氢气可以增强根系建立，增加抗病能力，并促进叶子、果实和种子的生长与发育（Hancock等人，2021）。将氢气加入植物作物的灌溉水中是一个相对简单的过程，可以通过多种方式实施。例如，作为种子预处理剂（见第六章第6.3节），氢气可以在播种前使用；或者，富含氢气的水和氢气气体可以作为萌发和成熟植物的局部应用。HRW和HNW也可以通过将氢气气体（通过水电解产生）扩散到营养溶液和灌溉系统中，以及通过在水溶液中溶解Mg或氢气供体（例如AB@hMSN、甲酸）来获得。这些方法已经在学术界得到实施（Felix等人，2019；Wang等人，2021b；Wang等人，2023b）。向土壤环境中添加氢气也被发现通过增加氢气氧化微生物活动和促进碳固定来改善土壤质量（Stein等人，2005；Piché-Choquette和Constant, 2019；Islam, Greening和Hu, 2023），这一过程被称为氢气施肥，但其过程相当复杂，可能会排除其在农业设置中的应用，并且这种类型的应用是否能提供大规模、长期的解决方案来补充贫瘠土壤还有待探索。
全球因负担增加（例如气候变化、污染和土壤侵蚀）导致的食物生产力损失估计每年约为1700亿美元（Razzaq等人，2021）。因此，迫切需要额外有效的手段来保持营养价值、防止新鲜农产品的腐败并延长其保质期。在这方面，有大量研究证明，在种子、幼苗和成熟植物的灌溉水中添加氢气的好处，其中，以HRW形式供应的氢气被证明能提高作物的生存能力和产量（Cheng等人，2021；Wang等人，2023b）。氢气的抗氧化活性被认为是主要的作用模式，涉及上调谷胱甘肽和硫代谢（Cui等人，2020），增强抗氧化基因表达（Wang等人，2023b）和促进激素合成（Felix等人，2019）。这种细胞保护作用提供了对生物和非生物压力因素的抵抗力，包括干旱（Yan等人，2022）、重金属毒性（Zhang等人，2017；Cheng等人，2021）、盐分增加（Wu等人，2020）、温度变化（Guan等人，2019；Wang等人，2023b）和病毒感染（Shao等人，2023）。
在这方面，氢气通过增强抗压性、提高作物产量和维护营养价值，可能增强粮食安全，尽管需要进一步研究和投资以探索氢气作为肥料的潜力。
9.3 研究需求
9.3.1 临床需求
在临床背景下，产氧氢设备的安全问题（Ichikawa等人，2023年）可能导致公共卫生设置中对这类疗法的实施产生犹豫。然而，由于氧气也是一种有害气体，并且在医疗领域内被常规使用，只要严格遵守指导方针，引入氧氢疗法是可行的。例如，当在家中使用纯氧时，建议患者不要将气瓶放置在热源或潜在点火源（如火、电器等）附近（国家卫生服务，2023b）。然而，由于产氧氢设备不需要储存此类易燃物质，风险得到了缓解。尽管如此，在临床或家庭使用普及之前，需要建立完整的安全协议。
由于缺乏关于吸入产品疗效的证据，需要进行扩展分析，涵盖最佳剂量和治疗持续时间的问题，以及纯氢气或氧氢气吸入是否具有更强的抗氧化/抗炎特性。此外，从可行性角度来看，进行比较分析不仅对于所声称的医学益处很重要，而且对于成本、环境影响、可持续性和所用材料的耐用性也很重要。研究新的氢气输送方法，如含氢凝胶、富氢水和纳米材料，也可能提供一种安全有效的临床施用氢气的方法。然而，在评估这些新颖的输送手段之前，还需要更多的证据。因此，如果将来要实现氢气的广泛医学应用，继续研究哪种氢气输送机制最适合个别情况也是必要的。
迄今为止，分子氢治疗在动物或人类身上没有显示出毒性，同时也有研究表明氢气不会在血液或组织中积累，多余的氢气会通过呼吸排出（Shin, 2014）。然而，氢气给药的积极效果在氢气被消除后仍能长期观察到，这需要长期的临床观察。因此，临床数据不仅需要考虑针对特定条件的输送机制，还需要考虑这种有效治疗的分布、剂量和持续时间。在大规模试验可以进行之前，有必要建立标准化的氢气含量和剂量限制。最后，为了全面了解氢气或氧氢气可能如何与药物和/或健康及生活方式补充剂相互作用，从而影响全球人口的健康，必须理解氢气抗氧化/抗炎活性的模式。为此，重要的是要识别氢气的主要分子靶点和化学相互作用，无论是在健康还是疾病状态下。
9.3.2 实证需求
显然，在氢气可以被视为全球卫生机构可开处方的治疗之前，需要考虑许多方面。未确定的氢生物化学因素，如扩散率和反应率、与含金属基团（如血红素）的相互作用以及磁自旋态可能有影响（第四章）。还需要确定氢气相互作用的主要靶点或多个靶点，以便识别分子机制（Hancock、LeBaron和Russell, 2021）。这项工作将支持临床数据，并可能表明氢气疗法是否有任何长期或不利影响。
为了增加对氢气生物化学的当前理解，需要在各种真核细胞上采用几种分析方法。例如，电子顺磁共振（EPR）光谱结合蛋白质特异性自旋标记可用于检测给定陷阱上的自由基或离子加合物，这些陷阱已知与特定的ROS或RNS反应。如果得到化学发光分析的支持，这项技术将允许对氢气清除活动与ONOO⁻和•OH进行比较评估，这可以应用于离体和体外分析。此外，使用p-氨基苯甲酸、2,4-和3,5-二甲氧基苯甲酸或羟苯基荧光素的改良CUPRAC测定可以被用作探针，用于鉴定和量化生物液体中的•OH（Li等人，2020）。利用这些技术将有助于提供进一步信息，以确定氢气是否可以减少或防止这种特定自由基的形成。除了荧光分析外，Halliwell等人（1987）开发了一个简单的且经济高效的脱氧核糖试管测定法，能够确定抗氧化化合物与•OH的反应速率常数。在这里，当向测定中添加•OH还原性抗氧化剂时，它们与脱氧核糖竞争，脱氧核糖是•OH氧化的主要目标，并抑制发色团的形成。通过分光光度法分析颜色形成的减少，可以推断出抗氧化剂与羟基自由基反应的速率常数（Halliwell、Gutteridge和Aruoma, 1987）。
关于氢气可能位于蛋白质口袋中和/或影响血红素动力学的理论（第四章第4.3.2节），可以进一步应用X射线晶体学、计算机模拟（例如X-PLOR（Brünger等人，1998））等方法。核磁共振（NMR）光谱也可以帮助我们定义蛋白质表面口袋或内部通道的区域，这些区域可能导致氢气-蛋白质亲和力和相互作用。此外，采用生物信息学方法来识别Xe结合口袋和/或通道是否有类似的配置，特别是在含血红素的蛋白质中，可能会提供有关这些结构是否保守以及氢气是否可能在维持细胞和更大生物体的氧化还原状态中发挥重要作用的宝贵信息。红外光谱、蛋白膜电化学和全细胞生化测定，如Lacasse等人（2019）开发的测定，也可能能够识别氢气是否影响复合体I的功能，而使用X射线晶体成像、基因编辑/突变和质谱等更复杂的技术可以帮助识别被氢气靶向的分子区域，应提供有关暴露于氢气的这类蛋白质的形式和功能的宝贵见解。了解氢气是否与其他气体或低分子量化合物竞争也可能是有益的，尽管上述技术的显著限制是需要冷冻样本进行分析，因此无法评估催化转化和动力学。
最后，为了确定氢气是否直接影响Ca2+信号事件，采用Ca2+特异性荧光探针（例如基于绿色荧光蛋白（GFP）的遗传编码钙指示传感器）等技术可能会有所帮助，这些技术最初由Nakai、Ohkura和Imoto（2001）开发。为了评估H2可能对磷酸化事件的影响，可以使用多种技术。例如，酶联免疫吸附测定（ELISA）可以检测目标蛋白质的磷酸化位点的抗体偶联，提供磷酸化蛋白质的半定量分析。或者，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定法也可以使用，它结合了磷酰基团（Kinoshita、Kinoshita-Kikuta和Koike, 2009）。此外，通过放射标记、质谱和西方印迹分析可以识别磷酸化蛋白质，同时一系列激酶活性测定也可能表明H2是否可能在蛋白质磷酸化的上游相互作用。应用此类分析应提供一个更全面的画面，以确定H2是否直接针对这类信号传导级联。
9.3.3 领域
为了更好地评估氢气支持食品生长、分配和生产行业的潜力，进行大规模的田间研究以及进一步的经验性调查氢气应用的主要、次要和可能是第三级效应将是有益的。分析长期氢气使用是否影响可遗传特征也可能是明智之举。这可能涉及了解表观遗传背景、激素调节以及对生物和非生物压力的抵抗力。
最近的研究，如Cheng等人（2021）进行的研究表明，富氢水（HNW）适合灌溉作物，因此，在考虑收获前施用时，关注氢气生产的这一方面可能是有利的。
对于采后应用，比较分析使用富氢水（HRW）/富氢水（HNW）或H2气体处理的效果，以及在分销链的哪个阶段应用最为有效，将大有裨益。
9.3.4 经济效益分析
不仅要仔细审查氢气疗法的功效，还要评估其成本效益、可持续性和长期益处。大规模使用氢气的一个主要问题是降低氢气生产成本。例如，水电解所需的能源占总成本的60%到80%（Blanco等人，2018）。然而，氢气生产所需的能源可以来自多种来源，包括现场发电机，包括太阳能和风能，以及国家电网。以每千瓦时5美分的电费计算，通过电解系统生产氢气的成本可能在每公斤（H2）5美元（美元）到10美元之间（Finke等人，2021）。然而，扩大这种环境负责任的电力来源（例如风能和光伏技术）的规模预计将使电解H2生产的成本在2050年降低30%-80%，使其接近于从化石燃料生产H2的成本（1-2美元）（Finke等人，2021）。此外，购买和维护成本，以及评估商业单元与常规治疗和过程相比的耐用性和寿命，也需要考虑在内。此外，为了全面了解在农业和医疗保健行业中利用氢气的经济可行性，考虑到尚未实施大规模研究来探索H2在任一行业的潜力，还需要评估施用方法以及在农业（例如采前/采后）或临床实践（例如紧急/康复护理）中引入H2疗法的最有效方式。
9.4 氢气使用风险控制
氢气在温度高于527°C时是易燃的，并且已知在氧气存在的情况下会发生爆炸反应（Ohta, 2014）。根据当代报告，空气中的H2不应超过4.6%，纯氧中的体积比不应超过4.1%（Huang等人，2010；Hu等人，2020）。作为一种纯气体，氢气是一种爆炸风险，因此在临床环境中存储如此挥发性的气体既不安全也不实用。为了减少吸入这种易燃物质所带来的危害，可管理浓度的氢气不应超过较低爆炸极限的三分之一。然而，由于已经证明2% 氢气具有治疗效果（Chen、Zhang和Qin, 2021），提供小体积的氢气可能会减少高风险投资的必要性。最近一份关于碱性电解槽（AE）和质子交换膜（PEM）发生器爆炸性的报告发现，爆炸的主要原因是在生产设备内部泄漏氢气（Ichikawa等人，2023）。此外，Leancat燃料电池技术公司最近在欧洲分子氢研究生物医学学院第1届国际会议上提出的研究报告表明，在连接管道的内部空间、滤瓶周围以及吸气管末端周围10厘米的区域内存在瞬态爆炸气氛是适用的（Matolin, 2022）。因此，在使用含氢气的气体时，确保环境和工作人员的安全与福祉至关重要。
由于氢气具有易燃性和潜在的爆炸反应，安全使用氢气需要适当的处理预防措施和程序。例如，在存储过程中，氢气需要储存在适当的气瓶中，并放置在通风良好的区域，远离热源、点火源和直接阳光照射（Abohamzeh等人，2021）。这一因素可能会对全面临床应用构成问题，特别是在英国和美国等实施严格患者安全政策的国家。气瓶还应定期检查是否有损坏，以减少泄漏的可能性。此外，由于氢气比空气轻，适当的气流和通风也是必要的，以防止氢气积聚。使用氢气的任何设备的设备、配件和连接也需要配备检测器/监测器，这些设备可以提供故障和氢气泄漏的早期警告。压力调节器和流量计可以检测突然的压力变化，并且可能在防止与氢气相关设备故障造成伤害方面起到重要作用。确保与氢气一起工作的个人接受了充分的培训，掌握安全处理、存储和紧急程序将是明智之举，培训应包括识别潜在危险以及如何应对可能涉及氢气的事件（例如疏散、火灾、泄漏等）。
在考虑利用电解水产生的氢气和氢氧混合气体吸入疗法时，气体混合物在生成后即被消耗，当系统不使用时生产就会停止。这种安全特性消除了对气体化合物进行危险储存的需求，提高了消费者、患者和医疗工作者的安全性。此外，氢气发生装置使用简单，需要较少的培训或维护，并且是一种可持续且环保的治疗性氢气供应方式。
第10章：结论
可以推断，由于作用机制未明确，缺乏主要靶点鉴定，加上给药方法、剂量和剂量频率方面的困难，以及治疗的长期效果和患者的固有抗氧化特征，因此有必要通过研究证明氢气如何能够合理且最有效地融入医疗保健实践。此外，从大量临床数据中获得的知识（补充部分：表1）转化为全球医疗保健实践的速度缓慢。
本论文的第3章探讨了氢气的进化需求和作用，评估了其与复合物I的氧化还原活性、辅酶Q结合亚基之间可能存在的祖先关系，发现尽管C. heimdallarchaeota氢化酶MbhL与亚基NDUFS2之间的同源性（27%）超过了显著性的阈值（Anderson和Brass，1998），但在活性位点的蛋白质序列之间几乎没有相似性。因此得出结论，如果NDUFS亚基源自功能性氢化酶，那么催化氢气的氧化/还原能力将取决于在活性位点保留镍。
尽管尚未完全阐明氢气的精确分子机制，但看起来氢气可能作为一种相当杂乱无章的分子，很可能与许多生物组分如糖原复合体、铁质辅基和其他金属离子（例如Ca2+）有松散的联系，也许还支持多种蛋白质结构和功能（第4章，第4.2.3节和第4.2.4节）。然而，目前尚不清楚的是，氢气是否也作为直接的抗氧化剂起作用，减少诸如•OH和ONOO-等有害的ROS/RNS（第4章，第4.2节），并且进一步的计算机模拟是必需的，以解释生理环境中更广泛的活动。
这里收集的数据表明，氢气疗法可以在不同的躯体系统中产生广泛的影响（第8章，第8.3节），其中许多有利属性与调节氧化还原环境及其伴随的抗炎质量有关（第1章）。氢气和氢氧疗法的一个额外好处是它们可以通过多种方式递送（第8章，第8.2节）。渐进式创新，如氢氧气吸入装置、可溶解和可食用片剂，以及盐水输注和氢气吸入，都易于管理。市场上可获得的仅含氢气和氢氧气吸入装置在产生的气体质量和体积上各不相同。本论文的第5章分析了HydroVitality碱性水电解、氢氧气发生器的气体输出，并确认产生的气体为约66% 氢气和约33% O2，流速为450mL/min。这种气体也可以在溶解到水溶液中时提高H2和O2的含量（第5、6和7章）。
在第7章的经验概念前沿，聚焦于p53阳性恶性B细胞（TK6细胞），评估了溶解氢气（300mL/min）和氢氧气（300 mL/min, H2 + 150 mL/min, O2）气体细胞培养基的效果。简而言之，用氢气或氢氧气灌注的培养基培养TK6细胞。氢气和氢氧气组在给药后24小时和48小时显示出细胞密度降低，与之前的研究一致（Liu等人，2019；Chu等人，2021），图7.7和7.8显示生长阶段1和2中的细胞数量减少，以及凋亡（Sub G1）显著增加，表明这些气体可能是肿瘤疾病有效的治疗手段。最后，第9章探索了知识上的空白，并提供了进一步实验的建议，这可能会为将氢气技术整合到农业和医疗保健行业中提供有价值的信息。
总之，本文主张进一步研究氢气疗法的临床使用。通过利用生物信息学、实证和理论分析，本文呈现的研究支持了现有文献，并证明了氢气很有可能在细胞以及更广泛的生物和躯体系统中提供有利的保护效应。
博士论文申请人Grace Russell的论文目录
Grace Russell List of Publications (2021 – 2024)
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