本研究作者均来自河北医科大学法医系，该系是我国法医学领域的领头雁。通讯作者文迪教授长期致力于氢气用于阿片成瘾效应和机制研究，获得了一系列重要研究成果，发现氢气对减少药物成瘾相关神经病理学改变有很好的缓解作用，并从神经药理学和肠道菌群等方面开展了机制研究探索，这些研究成果对于将氢气转化于药物成瘾的应用具有很高价值。氢气在药物成瘾方面研究也是中国学者独树一帜的非常有特色的工作，国际上没有其他团队开展这方面研究。

1. 引言

药物成瘾是一种慢性、反复发作的大脑疾病，它可能导致重大的健康、社会和经济问题。其特征是无法控制地寻求药物，同时承受严重的负面后果[1][2]。根据2023年世界毒品报告，阿片类药物仍然是造成严重毒品相关伤害的主要物质类别，包括致命过量。解毒后高复发率是一个基本的临床问题，也是治疗阿片类药物滥用的一个重大障碍[3]。药物成瘾可以被概念化为一种异常记忆，经历与其他记忆相似的认识过程[4]。作为减少复发可能性的手段，记忆消退的概念在最近几十年中获得了显著的关注和研究[5]。消退，一种涉及重复暴露于与药物相关的刺激的行为干预，可以有效地减少由这些线索触发的渴望和复发[6][7][8][9]。现有的基于消退原理的药理干预可以促进与药物相关的行为[10][11]。我们之前的研究结果表明，结合消退训练和消退后的黄连素治疗可以促进与药物相关行为的消退，使其成为预防复发的有吸引力的治疗候选物[12]。然而，由于侵入性和严重副作用，药物成瘾治疗在消退过程中的应用非常有限。

因此，开发新型、无害且非侵入性的行为或药物治疗方法，能够成功解决药物成瘾问题，是迫切和关键的。由于氢气（H2）的微小分子大小和非极性特性，它可以轻易穿透并到达任何器官或细胞器[12][13]。氢气的影响已被一致记录，特别是在氧化应激以及炎症和代谢性疾病方面。动物研究和各种生物医学领域的临床试验描述了氢气对各种神经疾病的可能作用机制，如药物成瘾、情绪障碍、神经病痛、阿尔茨海默症和帕金森病[12][14][15][16]。氢气在人体内的生理影响是温和的，到目前为止，没有检测到任何不良影响。此外，氢气可以通过不同的方式高效传递，如气体吸入、富氢水（HRW）和纳米晶体，以实现目标传递和控制释放[17]。研究人员最近发现，珊瑚钙氢化物（CCH），一种通过将珊瑚钙与氢气在高温下混合形成的多孔粉末，在与水接触时会逐渐且持续地产生和释放H2气体[18][19]。我们实验室之前的研究已经证明，引入氢气可以减轻对神经系统的有害影响和甲安非他明引发的海马突触可塑性的破坏。这种干预改善了小鼠的抑郁样行为、行为敏感化和空间记忆损伤[20][21][22]。然而，关于为阿片类药物成瘾者实施氢疗法的研究很少。

多项动物和人类试验表明，肠道微生物组参与发展神经精神疾病，包括药物成瘾和精神分裂症，以及自闭症谱系和情绪障碍[23][24]。我们之前的研究发现，甲安非他明使用者的肠道微生物组成发生了显著变化，包括拟杆菌属和罗氏菌属[25]。肠道微生物群缺失的小鼠对阿片类药物奖励显示出不寻常的行为反应，这表明缺陷奖励处理与肠道菌群失调之间存在联系[26]。该研究表示肠道细菌影响在成瘾相关行为中显著受影响的神经回路，并报告了支持肠道微生物群与阿片类药物相关行为之间双向关系的临床和临床前证据，强调了阿片类药物使用对肠道细菌的影响，以及肠道细菌对阿片类药物行为反应的影响。张等人记录了吗啡条件化后肠道微生物多样性的增加，随后在戒断4周后下降[27]。肠-脑轴提供了一条肠道微生物-物质成瘾通路。然而，关于不同阿片类药物成瘾阶段肠道微生物特征组成的知识有限。我们的研究构建了一个用于研究吗啡引发的条件性位置偏好（CPP）获取、消退和复燃的小鼠模型。在这里，我们采用了自由可及和限制性CPP消退范式来检查在关键消退时间窗口递送氢气（HRW和CCH）对吗啡诱导的药物消退相关行为的潜在影响。我们使用16S rRNA基因测序评估了吗啡对微生物多样性和组成的影响，以及氢气干预后微生物群的改变。同时，我们还对阿片类药物成瘾者进行了氢气（吸入）干预和肠道微生物群测试。我们的目标是为阿片类药物引起的成瘾开发一个有力的治疗靶点，并探索肠道微生物群机制。

2. 材料与方法

方案1：动物实验

2.1. 动物和药物

从中国辽宁长盛公司采购的7-8周龄雄性C57/BL6小鼠，在温度为22±1°C、湿度为60±5%的控制环境中适应，并保持12小时光照/黑暗周期。总共有72只C57/BL6小鼠用于动物实验，其中8只因吗啡条件性位置偏好（CPP）训练不成功而被排除。为了观察HRW对吗啡诱导的药物消退的影响，将16只小鼠分配到生理盐水处理组（对照组，n=8）和HRW处理组（n=8）。为了观察CCH100/200对吗啡诱导的药物消退的影响，将48只小鼠分配到生理盐水处理组（n=16，每个对照组n=8），CCH100/200处理组在自由可及和限制性消退范式下（n=32，每个CCH组n=8）。河北医科大学动物护理和使用委员会批准了所有动物处理。盐酸吗啡和HRW机器分别从青海制药厂有限公司和中国北京中庆源工程技术获得。HRW的浓度保持在约2.0 mg/L。此外，从上海全仁生物科技有限公司获得的CCH（100 mg/kg或200 mg/kg）在使用前悬浮于纯净水中。

2.2. 吗啡诱导的条件性位置偏好（CPP）

在此，我们采用了平衡且无偏见的协议。CPP得分的计算是通过在测试日分别减去在生理盐水配对和吗啡配对室中花费的时间。实验协议包括五个独立阶段：预测试、条件化、后测试、消退和复燃，过程参考我们之前的研究[13]。

预测试阶段（第1天）：将小鼠引入箱中，允许它们在整个装置中自由移动15分钟。任何在两个室之间活动时间差异超过150秒的动物都被排除在外。条件化阶段（第2-7天）：小鼠接受了为期6天的训练，期间它们接受间隔6小时的交替注射盐酸吗啡（10 mg/kg，腹腔内）或生理盐水（10 mL/kg，腹腔内）。每次注射后，小鼠被限制在与吗啡或生理盐水配对的室中45分钟。后测试阶段（第8天）：训练后的第二天，小鼠在与预测试相同的条件下进行CPP测试。CPP得分大于180秒的小鼠表明吗啡成瘾记忆模型已成功建立。消退阶段（第9-14天）：小鼠接受了两种类型的消退训练。第一种是非限制性消退训练，其中小鼠在灌胃给药后被允许自由进入CPP测试的整个装置15分钟。第二种是限制性消退训练，其中一个隔板隔离了两个室，小鼠在早上和下午接受灌胃给药后被限制在一个未配对的室中45分钟。每次消退训练前半小时内，通过灌胃给予小鼠HRW（约2 mg/L）和CCH（100 mg/kg或200 mg/kg）治疗。对照组通过灌胃给予生理盐水治疗。复燃阶段（第15-16天）：在第15天，进行了位置偏好测试，目的是确定吗啡诱导的CPP是否消退（T1）。第二天，小鼠接受了单次吗啡注射，随后进行了位置偏好测试（T2）。在第1天（预测试）、第8天（CPP测试的最后一天）和消退阶段结束（测试，第15天）分别收集了粪便样本（图2A）。从每只小鼠收集的粪便样本放入2 mL Eppendorf管中，置于干冰中，并运送到实验室。使用2.0%戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉。

2.3. 粪便样本DNA提取和16S rRNA基因测序

2.3.1. 基因组DNA提取

采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和十二烷基硫酸钠（SDS）方法从粪便样本中提取全基因组DNA。随后，我们通过使用1%琼脂糖凝胶来评估DNA的浓度和纯度。

2.3.2. 扩增子生成

使用带有条形码的特定引物来扩增16S rRNA基因的V3/V4区域。本研究在30 µL反应体系中进行所有PCR，包含15 µL的Phusion®高保真PCR主混合物（New England Biolabs），0.2 µM正向和反向引物，以及近10 ng模板DNA。热循环条件的调整为：98°C持续1分钟；98°C 10秒和50°C 30秒的30个循环；最后在72°C延伸30秒；最终温度固定在72°C持续5分钟。

2.3.3. PCR产物的混合和纯化

在此，我们将PCR产物与等体积的1×加载缓冲液（含有SYBR绿色）混合。随后通过2%琼脂糖凝胶电泳确定混合物。所有PCR产物按照每个产物具有相等密度的比例混合。随后，PCR产物通过GeneJETTM凝胶提取试剂盒（Thermo Scientific）进行纯化。

2.3.4. 文库制备和测序

使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns（Thermo Scientific）来生成测序文库。通过Qubit@ 2.0荧光计（Thermo Scientific）进行文库质量评估。在Ion S5TM XL平台上进行文库测序后，生成了400/600 bp的单端序列。

2.3.5. 肠道微生物组分析

2.3.5.1. 单端读取质量控制

使用Cutadapt（Martin M, 2011）（V1.9.1）质量控制方法根据特定条件过滤原始序列，以获得高质量序列。本研究通过UCHIME算法将序列与参考数据库（Silva数据库）进行比较，旨在识别并消除任何嵌合序列，从而获得可读序列。

2.3.5.2. 操作分类单元（OTUs）聚类和物种注释

在此，我们利用UPARSE软件（v7.0.1001）进行序列分析。使用97%的相似性阈值进行序列聚类成OTUs。筛选出的每个OTU的代表序列用于后续注释。为了确定多个OTU之间的系统发育关系以及不同样本（组）中优势物种的变化，我们使用MUSCLE软件（版本3.8.31）进行多序列比较。标准化的数据输出被用来进一步检查α多样性和β多样性。

2.3.5.3. α多样性

通过应用六个指数：观察到的物种、Chao1、Shannon、Simpson、ACE和优秀覆盖率来评估样本中的物种多样性复杂性。这就是所谓的α多样性分析。在这里，通过QIIME（版本1.7.0）和R软件（版本2.15.3）分别计算和可视化这些指数。

2.3.5.4. β多样性

使用主坐标分析（PCoA）获取主坐标，以便将复杂的多维数据可视化。之前生成的braycurtis距离矩阵被转换为新的正交轴集，其中第一和第二主坐标分别代表最大的方差组分和因子。使用WGCNA软件呈现PCoA分析。对于距离矩阵的分析，我们采用非加权组平均法（UPGMA）聚类方法，它通过QIIME软件（版本1.7.0）使用平均链接。

2.4. 血清代谢物分析

2.4.1. 标准曲线建立

称量乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸的标准品，并用乙醚制备成0.02、0.1、0.5、1、2、5、10、25、50和100 μg/mL十个浓度梯度。储备液和工作标准液保存在0°C。

2.4.2. 代谢物提取

用移液管将样本引入2 mL离心管中。在制备含有50 μL 1.5%磷酸、10 μL 75 μg/mL异己酸（内标）和140 μL乙醚的混合物后，对其进行1分钟涡旋和在4°C下以12000 rpm离心10分钟。最终收集上清液进行GC-MS分析。

2.4.3. GC-MS检测

样本分离是使用气相色谱系统（PerkinElmer Clarus 680/SQ 8气质联用仪，PerkinElmer，美国）在Agilent HP-INNOWA毛细管柱（30 m × 0.25 mm ID × 0.25 μm）上进行的。关于分流进样，进样量调整为1 μL，保持分流比为10:1。样本入口温度为250度，离子源为300度，传输线为250度。初始温度为90°C，以10°C/min的速率升至120°C，然后以5°C/min的速率升至150°C，最后以25°C/min的速率升至250°C，并保持2分钟。使用氦作为载气，流速为1.0 mL/min。SIM扫描使用电子轰击电离（EI）源，电子能量为70 eV。

方案2：人群基础研究

2.5. 研究对象

从横断面和纵向研究（ChiCTR2100045976）中连续招募有成瘾问题的人。本研究共招募了108名受试者，这些受试者被分为阿片类药物组（n=58）和健康对照组（HCs）（n=50）。在2019-2021年期间，从河北和山西省的戒毒中心招募了58名阿片类药物成瘾者（7名海洛因滥用者、50名吗啡滥用者和1名芬太尼滥用者）作为研究受试者。在为期三个月的随访期间，50名阿片类药物成瘾者被分配接受常规治疗（对照组；n=25）、吸氢治疗（吸氢组；n=25）或两者兼有。吸氢组的25名参与者保持坐姿，随后通过鼻管连接到氢气吸入器，气体流速为150mL/min。氢气吸入治疗持续每天2小时，为期3个月。氢气由北京中氢源工程技术有限公司提供。健康对照组则从河北省人民医院体检中心招募，与药物成瘾者的年龄和性别相匹配。设计了一份基本信息问卷用于实验，包括关于药物成瘾者的年龄、婚姻状况、教育和就业水平的问题。在隔夜禁食后的早晨，受试者自行收集氢气吸入治疗前后的粪便样本，并立即送往实验室，每个样本分成两部分，装入两个冷冻管中，然后在液氮中过夜冷冻并在-80°C下保存以供后续测试。河北医科大学精神卫生研究所的专业神经学家和精神病学家评估了视觉模拟量表（VAS）、自评抑郁量表（SDS）和自评焦虑量表（SAS）。所有实验程序均经河北医科大学医学伦理委员会批准，符合伦理委员会指南，所有参与者均签署了知情同意书。

2.6. 粪便样本DNA提取和16S rRNA基因测序

本节的实验方法与2.3节相同。

2.7. 统计分析

使用GraphPad Prism 9.1.1进行统计分析，数据表示为平均值±标准误（SEM）。采用Mann-Whitney U检验和卡方检验分别确定定量数据和定性数据的差异。对于控制和氢气治疗前后各量表的变化比较，我们使用了配对样本Wilcoxon符号秩检验。采用学生t检验或双因素重复测量ANOVA进行统计分析，P<0.05表示差异显著。

3. 结果

第一部分：基于动物的实验结果

3.1. CCH促进吗啡诱导的消退

3.1.1. HRW对吗啡诱导的CPP非限制性消退范式的影响

CPP训练、测试、HRW治疗和复燃遵循时间线（图1A）。16只小鼠在吗啡-CPP上表现出显著差异（t=12.72, p<0.0001）（图1B）。随后，这些小鼠被分配到对照组和HRW治疗组（每组n=8），重新引入自由进入CPP（非限制性）消退范式，并分别给予生理盐水（1mL/kg, i.g.）和HRW（2mg/L, i.g.）治疗。这种给药在消退训练前30分钟进行，持续6天。双因素ANOVA结果显示，CPP分数在HRW干预（F(1, 14) = 0.7759, p=0.3933）、消退会话（F(5, 70) = 5.416, p=0.503）以及HRW干预×消退交互作用（F(5, 70) = 0.2843, p=0.9202）之间没有显著差异。总的来说，HRW治疗不影响自由获取的吗啡诱导CPP消退范式（非限制性消退）。

图1. 氢气对吗啡消退引起的药物相关行为的影响。(A, E) 行为训练和测试以及富含氢水（HRW）/珊瑚钙氢化物（CCH）处理的自由获取（非限制性）CPP消退范式的时间线。(B, F, J) 在CPP训练前后的吗啡组的CPP得分。与预测试相比，吗啡配对的CPP训练后显著的地方偏好（n = 16; ****p < 0.0001）。(C, G) 非限制性CPP消退范式中吗啡消退引起的药物相关行为。分别给对照组和氢气治疗组口服生理盐水（1 mL/kg, i.g.）以及HRW（2 mg/L, i.g.）/CCH（100 mg/kg和200 mg/kg, i.g.）。(D, H, K) 吗啡触发的CPP的复燃。在复燃测试1和2前10分钟分别注射启动生理盐水（1 mL/kg, i.p.）和吗啡（3 mg/kg, i.p.）。n = 8/组。****p < 0.0001, ns: 无显著性（p > 0.05）。数据以平均值±标准误（SEM）表示。（I）限制性CPP消退范式中的行为训练和测试以及CCH处理的时间线。

在整个复燃会话中，初步注射生理盐水（1 mL/kg, i.p.）或吗啡（3 mg/kg, i.p.）在复燃测试1和2前10分钟进行，CPP得分之间无显著差异（图1D）在对照组和HRW组之间（F (1, 14) = 0.1676, p = 0.6854）在测试2。我们的数据表明，HRW治疗不能抑制启动后吗啡寻求行为。

3.1.2. CCH对自由获取CPP消退范式中吗啡诱导的CPP消退的影响

CPP训练、测试、CCH处理和复燃遵循时间线（图1E）。二十四只小鼠在吗啡-CPP上表现出显著差异（t = 11.62, p < 0.0001）（图1F）。小鼠被分为三个依赖组（n = 8/组），随后被重新引入自由获取CPP的非限制性消退范式。对照组口服给予1 mL/kg生理盐水，而CCH治疗组口服给予100和200 mg/kg的CCH。这种给药在为期6天的消退训练会话前30分钟进行。重复测量的双因素ANOVA显示，不同CCH剂量（F (2, 21) = 13.73, p = 0.0002）和消退会话（F (4, 80) = 6.188, p = 0.0003）之间CPP得分显著不同。总的来说，CCH治疗能够增强吗啡诱导的自由获取CPP消退范式的消退。

在复燃测试1和2之前，初步注射生理盐水（1 mL/kg, i.p.）或吗啡（3 mg/kg, i.p.）在10分钟前进行。Tukey的事后测试结果显示，在自由获取CPP消退范式下，对照组和CCH200组（200 mg/kg, i.g.）之间的CPP得分有统计学上的显著差异（p < 0.0001）（图1H）。数据表明，给予CCH200作为干预可以有效防止吗啡CPP的药物启动复燃。

3.1.3. CCH对限制性CPP消退范式中吗啡诱导的消退的影响

通过限制性CPP消退范式研究了CCH对与吗啡诱导的药物消退相关行为的影响（图1I）。由于24只小鼠中有3只表现出对某个隔间的强烈初始偏好或未能完成训练，因此被排除在外。剩下的21只小鼠在吗啡-CPP上表现出显著差异（t = 13.53, p < 0.0001）（图1J）。这21只小鼠进一步被分配到三个依赖组（n = 8/组），随后被重新引入限制性CPP（受限）消退范式。对照组和CCH治疗组分别口服给予生理盐水（1 mL/kg, i.g.）和CCH（100和200 mg/kg, i.g.）。双因素ANOVA（重复测量）表示，CCH剂量（F (2, 42) = 6.032, p = 0.005）以及限制性消退会话（F (1, 42) = 18.79, p < 0.0001）之间CPP得分显著不同。与对照组相比，CCH200治疗后的CCP得分显著降低。一致地，CCH200可以促进吗啡消退相关行为，从而减少吗啡CPP的复燃。

3.2. 吗啡扰乱肠道微生物群

3.2.1. 吗啡对微生物多样性和组成的影响

在此，我们通过16S rRNA基因测序分析了对照组、吗啡诱导的CPP（CPP）组和自由获取消退（fa-EXT）组的肠道微生物群特征。此外，我们基于OTU分析物种丰富度检测了细菌种类的数量。CPP组和fa-EXT组中的OTU类型数量大大少于对照组（表S1）。图2A显示了自由获取CPP消退范式中行为训练和测试的时间线以及粪便和血清样本的收集时间。通过未加权PCoA明显揭示了微生物群落组成在β多样性中的变化（图2B）。基于样本距离，CPP（Adonis: R2=0.17943, p = 0.001）和fa-EXT（Adonis: R2 = 0.2571, p = 0.002）组与对照组明显分开。结果表明两组之间无显著差异。

图2. 吗啡对微生物多样性和组成的影响以及CCH干预后的微生物群变化 (A) 自由获取（非限制性）CPP消退范式中行为训练和测试的时间线以及粪便和血清样本的收集时间。(B) 基于Bray-Curtis指数的控制组（蓝色）、吗啡-CPP组（绿色）和自由获取消退（红色）组细菌β多样性的PCoA分析。在门(C)和属(D)水平上肠道微生物相对丰度。(E) 控制组、吗啡-CPP组和自由获取消退组之间在细菌门以及科和属水平上的相对丰度比较。**p < 0.01。(F, G) 来自LEfSe分析的分类进化分枝图。控制组（绿色）、吗啡-CPP组（红色）和自由获取消退组富集的分类群（蓝色）显示正LDA得分。(H) 自由获取（非限制性）CPP消退范式中行为训练和CCH200干预的时间线以及粪便样本的收集时间。(I) 基于Bray-Curtis指数的吗啡-CPP组（红色）和CCH200组（蓝色）细菌β多样性的PCoA分析。在门(J)和属(K)水平上肠道微生物相对丰度。(L) 吗啡-CPP组和CCH200组之间在细菌门、科和属水平上的相对丰度比较。**p < 0.01, ***p < 0.001。(M, N) 来自LEfSe分析的分类进化分枝图。吗啡-CPP组和富集的分类群显示正（绿色）和负（红色）LDA得分。

图2C-D分别以堆叠条形图显示了在门和属水平上肠道微生物相对丰度。在三个组中检查了细菌门、科和属水平上的相对粪便微生物丰度（图2E）。与对照组相比，自由获取消退组在门水平上显示出显著更高的厚壁菌门比例。然而，拟杆菌门在自由获取消退组中显著降低。在科水平上检查细菌群落时，毛螺科在自由获取消退组中更为普遍。

通过LEfSe方法进行的宏基因组分析检查了吗啡对微生物群的影响。这种分析提供了对不同分类级别上微生物群落结构和相对微生物丰度的见解（图2F-G）。毛螺科在吗啡-CPP组中最丰富，而毛螺科和梭菌目在自由获取消退组中最丰富。相比之下，乳杆菌科、芽孢杆菌目和海线菌科在对照组中最丰富。这些优势类型在塑造三组间观察到的肠道微生物群差异中发挥了重要作用。因此，吗啡诱导的CPP和自由获取消退影响了小鼠肠道微生物群的多样性、组成和结构。

3.2.2. CCH干预后的肠道微生物群改变

为了调查CCH对吗啡成瘾消退影响的肠道微生物作用，对CCH200组和吗啡-CPP组进行了16S RNA测序。CCH200干预后，CCH200组的OTU类型数量明显多于吗啡-CPP组，与对照组的差异不显著（表S2）。图2H显示了自由获取CPP消退范式中行为训练和CCH200治疗的时间线以及粪便样本的收集时间。PCoA分析表明，CCH200组中微生物群落组成的改变与吗啡-CPP组明显分离（Adonis: R2=0.23511, p = 0.002）（图2I）。在三个组中调查了粪便微生物的相对丰度，包括细菌门、科和属水平（图2J-K）。与吗啡-CPP组相比，CCH200组在门水平上显示出显著更低的厚壁菌门比例。然而，CCH组的拟杆菌门水平显著更高（图2L）。在CCH200组中，乳酸杆菌和异毛螺属在属水平上被发现更为丰富。LEfSe分析阐明，CCH200组的拟杆菌门最为丰富，而吗啡-CPP组的厚壁菌门最为丰富（图2M-N）。数据表明，CCH 200干预对由吗啡引起的肠道菌群结构改变具有显著的积极影响。

3.3. 短链脂肪酸（SCFAs）代谢物分析

由于毛螺科、乳酸杆菌和异毛螺属已被表征为产生SCFAs，并且在吗啡CPP组和CCH200组中丰富，我们提出假设，SCFAs可能被吗啡和CCH200给药改变。通过GC-MS分析，我们分析了三组血清中SCFAs的相对浓度。数据显示，吗啡组中的乙酸浓度显著高于对照组（p < 0.001）（图3A）。经过CCH200干预后，乙酸浓度降至接近正常水平（p < 0.01）（图3B）。与CPP组相比，CCH200组中发现丁酸的变化增加。我们还观察了丙酸、戊酸、异丁酸和己酸的趋势，这三组之间没有差异（图3C-E）。

图3. 对照组、吗啡-CPP组和CCH200组血清样本中微生物代谢产物短链脂肪酸的分析。* p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。（对照组接受生理盐水治疗；CPP组在测试后消退期接受生理盐水治疗；CCH200组在测试后消退期接受CCH200治疗）。

第二部分：基于人群的研究结果

3.4. 阿片类药物研究人群的特征

108名受试者包括阿片类药物（n = 58）和健康对照组（HCs）（n = 50）两组。年龄、婚姻状况和教育水平在两组之间没有显著差异（表1）。卡方检验结果显示，两组之间的就业水平有显著差异，阿片类药物组的失业率更高（χ2 =5.631, p <0.0001）。阿片类药物组的SDS和SAS水平比HC组高（33 [30], [36] vs. 55 [44,63], p < 0.0001; 32 [28], [36] vs. 40 [33.75,46], p < 0.0001；分别见表1）。

为了评估吸入氢气干预对阿片类药物滥用者的药物渴望和精神疾病的影响，我们进行了为期3个月的随访试验，包括一个吸入氢气组和一个对照组（不吸入），由阿片类药物滥用者组成。随访期结束后，每组的VAS分数与基线值相比没有统计学上的显著变化（表2）。通过吸入滥用阿片类药物的干预组参与者在随访期间SDS（p <0.0001）和SAS（p <0.0001）得分显著降低，对照组中的差异不显著（SDS: p =0.1007, SAS: p = 0.1783）。这些发现表明，吸入氢气对于阿片类药物引起的精神障碍具有显著的有益影响。

表2. 吸入氢气干预在阿片类药物滥用者中的指标统计分析。  

3.5. 阿片类药物滥用者的肠道微生物群

分别使用16S rRNA基因测序检查了滥用阿片类药物的参与者和HCs的肠道微生物群。与阿片类药物组相比，每组中独特的OTU类型数量有所减少（表S2）。PCoA分析显示，两组之间微生物群落组成有明显的区别（Adonis: R2=0.04666, p = 0.001）（图4A）。图4B-C的物种堆叠条形图展示了门和属级别上肠道微生物类群的相对丰度。在门和属级别上，阿片类药物组的放线菌和双歧杆菌科的比例分别显著高于HC组。然而，在属级别上，Faecalibacterium在阿片类药物组中与HC组相比显著减少（图4D）。LEfSe分析显示，Lachnospiraceae、放线菌和双歧杆菌在阿片类药物组中丰富。同时，Megamnpas、瘤胃球菌科和Faecalibacterium在HC组中最丰富（图4E-F）。总的来说，阿片类药物可能会改变阿片类药物滥用者肠道微生物群的多样性、组成和结构。

图4. 阿片类药物滥用者的微生物多样性和组成以及吸入氢气干预对肠道微生物群的影响。（A）HC（蓝色）和阿片类药物（红色）组的PCoA分析。在门（B）和属（C）级别上肠道微生物类群的相对丰度。(D) HCs和阿片类药物组之间在细菌门、科和属级别上的相对丰度比较。*p < 0.05, ****p < 0.0001（E，F）来自LEfSe分析的16S序列的分类进化分枝图。阿片类药物-（绿色）和HC-富集（红色）的分类群显示正LDA得分。（G）基于Bray-Curtis指数的阿片类药物（红色）和吸入氢气（绿色）组间细菌β多样性的PCoA分析。在门（H）和属（I）级别上肠道微生物类群的相对丰度。（J）阿片类药物和吸入氢气组之间在细菌门、科和属级别上的相对丰度比较。*p < 0.05（K，L）来自LEfSe分析的16S序列的分类进化分枝图。阿片类药物和吸入氢气组富集的分类群分别用正（绿色）和负（红色）LDA得分表示。

为了研究氢气在阿片类药物滥用者肠道微生物中的作用，对吸入氢气组和不吸入（阿片类药物对照组）进行了16S RNA测序。经过吸入氢气干预后，吸入氢气组的OTU类型数量与阿片类药物对照组相比没有显著变化（表S3）。PCoA分析结果显示，吸入氢气组的微生物群落组成的变化与阿片类药物对照组明显分离（Adonis: R2=0.03651, p = 0.004）（图4G）。物种堆叠条形图代表了门（图4B）和属（图4H-I）级别的肠道微生物类群相对丰度。在门级别上，与阿片类药物对照组相比，吸入氢气组的拟杆菌门比例显著增加（图4H）。LEfSe分析还显示，双歧杆菌和放线菌在吸入氢气组中最丰富。同时，拟杆菌门在阿片类药物对照组中最丰富（图4K-L）。结果表明，吸入氢气干预可能不会增加微生物多样性，但会改变阿片类药物滥用者的肠道微生物群结构。

4. 讨论

本研究中进行了基于动物的实验和基于人群的研究，以揭示氢气是否可以作为药理学干预剂来减少阿片类药物寻求复发的风险以及潜在的肠道微生物机制。基于动物的实验结果表明，在关键的记忆力巩固时间窗口内进行消退训练过程中的氢气干预增强了吗啡引起的药物相关行为消退，并阐明了氢气对吗啡成瘾消退治疗作用背后的潜在肠道微生物机制。此外，我们对阿片类药物成瘾者进行了氢气干预，发现干预后阿片类药物成瘾者的心理症状得到改善，且肠道微生物群的结构和丰度发生了变化。这两部分共同解释了氢气作为一种新颖有效的干预手段，在阿片类药物相关复发行为中的作用，并揭示了肠道微生物的机制。

基于动物的实验显示，结合消退训练和CCH200疗法增强了吗啡在两种CPP消退范式中产生的药物相关行为，此外还减少了药物引发的复吸。在CPP训练期间，环境线索与吗啡的奖励效应联系在一起。消退通过创建新的抑制性记忆逐渐减少获得的反应，这种记忆阻碍了最初记忆的表现。我们采用了无限制和有限制的CPP消退协议。多项调查已经阐明，这两种消退策略都有效地导致了药物引发的CPP的消除。然而，这两种方法之间的差异仍然不清楚。有趣的是，有限制的CPP消退显著减少了三组小鼠中的吗啡诱导CPP，但只有CCH200组在自由访问CPP消退计划结束时能够满足消退标准。先前的研究表明，对于可卡因诱导成瘾的小鼠，经过一个自由访问CPP消退计划后，动物们在第七天仍然比与生理盐水相关的室花费更多时间；而对于吗啡诱导的CPP消退大鼠，重复测试组在经过10天的单次CPP测试后未能满足消退标准。这些结果表明，每日一次的CPP测试有可能提醒维持药物相关刺激的重要性，因此与有限制的消退相比，需要更多时间进行消退。

由于其抗氧化和抗炎特性，氢气代表了针对成瘾系统的潜在非药物疗法。自从2007年揭示其抗氧化特性以来，利用氢气进行疾病治疗的兴趣一直在增长。此后，2000多篇科学文章阐明了它在体外和体内动物及人体研究中的广泛治疗指征。临床实验证明了氢气的安全性，并展示了其在包括运动医学、认知障碍、中风、癌症、代谢综合征以及COVID-19患者等不同医学领域的益处。最近几项研究显示，富含氢的水（HRW）、富氢盐水或吸入氢气在炎症、行为障碍、神经疾病和药物成瘾的实验动物模型中有积极效果。最近发现的CCH，来源于珊瑚钙，与水接触时产生氢气。我们的结果显示，与HRW相比，CCH（200 mg/kg, i.g.）具有促进吗啡消退相关行为和减少吗啡CPP复燃的能力。此外，CCH给药的效果在吗啡诱导的自由访问CPP消退范式上比HRW更持久和显著。

药物成瘾代表了一种慢性复发性脑疾病。在过去的几十年里，尽管我们在理解药物成瘾的神经机制方面取得了重大突破，但对药物成瘾的有效治疗方法仍然难以捉摸。肠道微生物群，一个新颖的治疗目标，已被指出通过微生物-肠-脑（MGB）轴与大脑相互作用，控制多个生理过程。肠道微生物群及其代谢物通过这一途径对药物成瘾的影响越来越受到认可。我们的结果揭示了吗啡诱导的CPP获取降低了微生物群落的丰富度，并与对照组小鼠中的fa-EXT组相比，改变了分类多样性、组成和结构。一致地，这些结果与之前关于吗啡诱导的CPP小鼠模型中肠道微生物修饰的研究相符，但在他们的研究中，吗啡条件作用后社区丰富度增加。我们的结果显示，吗啡-CPP组中Firmicutes的丰度最高，而Udhghatri等人报告说，吗啡处理导致Parasuterella excrementihominis、Burkholderiales bacterium 1_1_47、Enterococcus faecalis、Enterorhabdus caecimuris的显著扩张和Lactobacillus johnsonii的减少。研究发现，有益细菌如Lactobacillus和Biffdobacterium在吗啡耐受的小鼠中显著减少。实际上，在肠道水平上，有益细菌（如Lactobacillus和Biffdobacterium）对肠上皮细胞完整性具有显著的保护作用。发现了特定的微生物群标志物，以更准确地定义不同的吗啡诱导的CPP阶段。小鼠肠道微生物群的多样性和数量可能受到吗啡训练的影响，可能是由于肠上皮屏障功能受损、屏障通透性增加或炎症因子表达失调。这可能是由于反复使用吗啡导致的肠道内衬完整性受损、保护性屏障通透性增加或体内免疫反应紊乱。这些因素可能导致肠道微生物群病理性移位或扰动。现有研究表明，操纵肠道微生物群可以作为一种新的创新治疗方法。在哺乳动物中，氢气构成了肠道中的主要气体；已揭示70%的胃肠道微生物遗传编码了产生氢气的能力。这表明氢气可以影响肠道微生物群的多样性和组成。本研究进行了16S rRNA分析，证明氢气，特别是CCH 200干预，通过降低Firmicutes-Bacteroidetes比例和增加如Lactobacillus和Alloprevotella等相对益生菌的丰度，显著改善了吗啡诱导的肠道菌群结构变化。Han等人发现，氢气可能归因于增加有益细菌、抑制有害细菌和代谢紊乱，以及减少炎症。

氢气可能成为治疗阿片类药物成瘾的有前景的选择。

这项研究探讨了氢气对吗啡诱导的条件性位置偏好（CPP）行为的影响，以及它如何通过调节肠道微生物群和短链脂肪酸（SCFAs）来减轻由吗啡引起的焦虑和抑郁症状。研究发现，氢气能显著改善由阿片类药物引起的精神障碍，降低视觉模拟评分（VAS）、自评抑郁量表（SDS）和自评焦虑量表（SAS）的分数。此外，氢气还能改变肠道微生物群的多样性、组成和结构，特别是在阿片类药物滥用者中。

在动物实验中，氢气干预降低了吗啡诱导的CPP行为，并减少了肠道中产生SCFAs的细菌数量，如Prevotellaceae、Lactobacillus和Alloprevotella，同时增加了乙酸的浓度。这些发现表明，肠道细菌及其代谢产物在调节吗啡诱导的CPP行为中起着关键作用。

然而，这项研究存在一些局限性，包括评估肠道微生物群和代谢物的样本数量有限，以及没有研究不同类型的阿片类药物对氢气吸入干预的不同反应。为了更深入地了解氢气在神经精神疾病和阿片类药物成瘾者中的治疗益处，需要进行更多的长期研究和大规模的阿片类药物研究。

总的来说，这项研究表明氢气可能是一种有前景的治疗阿片类药物成瘾的选择，它能够改善由吗啡引起的焦虑和抑郁症状，并对肠道微生物的性质产生积极影响。