Cre-LoxP系统是一种经典的基因编辑工具，可以在小鼠特定的发育阶段进行诱导型的基因编辑。该系统由两个核心元件组成：

l Cre重组酶（Cre recombinase）：来源于P1噬菌体，能够特异性识别LoxP位点并介导DNA重组，一般与ERT2融合表达，Cre-ERT2与胞内热休克蛋白结合，滞留于细胞质内无法进入细胞核；外源加入的Tamoxifen （他莫昔芬，AbMole，M7353）或者4-Hydroxytamoxifen（AbMole，M10252） 会结合ER结构域并解离热休克蛋白，此时Cre重组酶可以入核并识别LoxP位点，启动后续的基因编辑。

l LoxP位点（Locus of X-over P1）：一段34 bp的DNA序列，由两个13 bp的反向重复序列和中间8 bp的核心序列组成，可被Cre重组酶识别。

图 1. Cre-LOXP作用机理^[1]

待Cre-loxP条件性基因编辑小鼠品系构建繁育完成后，Tamoxifen诱导基因重组的给药窗口可依据实验类型和研究目的灵活差异化选择：针对成年组织稳态、器官病变及成熟体细胞功能相关研究，一般选取 6～8 周龄成年小鼠开展连续腹腔注射诱导；若聚焦青春期器官发育、幼年细胞分化相关课题，则可于小鼠出生后 21 日启动给药。接下来为大家详解Tamoxifen（ICI47699，CAS：10540-29-1）的配置和使用。

Tamoxifen的配制步骤

l 实验试剂或设备

1. Tamoxifen （AbMole，M7353）

2. 玉米油 （Corn oil，AbMole，M9109）

3. 50 mL 避光离心管（或者用锡纸包裹普通离心管）

4. 以下任意一种：超声波清洗仪、37℃恒温摇床、旋转混合仪

5. 无菌注射器与针头

6. 0.22μm无菌针头式过滤器（耐有机溶剂型，如PVDF或PTFE材质的过滤器）

l Tamoxifen的溶解步骤：

1. 根据注射剂量和小鼠体重推算Tamoxifen母液浓度，我们建议每只小鼠最终注射体积不超过100 μL。Tamoxifen在小鼠中的注射剂量一般为75 mg - 100 mg/kg/Day，最常使用的母液浓度为20 mg/mL，即称取Tamoxifen粉末200 mg加入10 mL玉米油（上述剂量和溶解方式仅为举例说明）。

Ø 注意：

配置的动物实验用溶液尽量做到现配现用；切勿一次性溶解所有或大部分产品；

Tamoxifen对光敏感，配制和保存时建议全程避光；

Tamoxifen的剂量在不同小鼠或者Cre重组酶中可能有差异，不同剂量可参考附表1或参考其它相关文献。

2. 随后可在超声清洗仪中，室温超声30分钟，以促进Tamoxifen的溶解，或者放置于37℃的摇床或旋转混合仪中进行过夜溶解。

注意：必要时可37℃水浴加热辅助溶解，但请勿过度加热。

3. 过滤除菌：溶解后的Tamoxifen在进行储存前，要用 0.2 μm的滤膜进行过滤。

4. 配制好的Tamoxifen可在2-8℃下避光保存一周，超过一周请进行报废处理；如需长期储存可分装后保存于-80 ℃冰箱中，在复溶时可能会出现少许沉淀，超声或者水浴加热后会再次溶解。

Tamoxifen的注射步骤

Tamoxifen的小鼠给药方式有腹腔注射和灌胃两种类型，其中腹腔注射更容易控制剂量，是最常用的方法。

l 小鼠腹腔注射步骤：

1. 根据小鼠体重与目标给药剂量（例如 75 mg/kg）计算注射体积。举例：25 g 小鼠，使用 20 mg/mL 储备液，若给药剂量 75 mg/kg，单次注射体积约 94 μL。

2. 使用无菌注射器，将他莫昔芬药液缓慢注射至小鼠右下腹部（可将小鼠腹部分为四个象限，第四象限即右下腹部器官相对较少），操作时避开内脏器官，多次注射时需注意更换注射部位，交替进行注射。

图 2.大鼠腹部四象限的划分（小鼠与之近似）^[2]

3. 一般情况下每 24小时注射 1 次，按实验需求连续给药；最常用方案为连续注射5天。

4. 给药全程密切观察小鼠，及时发现各类不良反应，已注射的小鼠和未注射的小鼠之间需严格分笼。

5. 完成最后一次注射后，通常至少等待 7 天再开展组织样本检测，此时 DNA 重组效率达到峰值，同时小鼠体内的药物也将充分代谢。

l 小鼠灌胃给药步骤：

1. 口服给药剂量常采用单只小鼠固定给药量（例如每只 3 mg），而非按体重换算给药。

2. 小鼠固定：轻柔固定小鼠，稳住小鼠头部，保证其呼吸顺畅不受阻碍。

3. 选用小鼠专用灌胃针，将针头从小鼠口腔伸至舌根后方，把液体直接送入食道。

4. 每日灌胃 1 次，按实验需求连续给药，通用方案为连续给药 5 天。

5. 给药完成后观察小鼠，确认是否出现应激、食道损伤等异常情况。

图3. 大/小鼠灌胃针的选择示意图: A图过长，B图最佳，C图过短，D图为触摸最后一根肋骨以确定合适长度的灌胃针^[2]

附表1. Tamoxifen在不同小鼠模型中的给药剂量和注射方式

范例详解

Sci Immunol. 2024 Aug 2;9(98):eadk2612. （IF = 16.3）

中国科技大学的研究人员在上述文章的实验中选用了由AbMole提供的Tamoxifen（他莫昔芬，AbMole，M7353），该化合物可激活小鼠体内Cre 重组酶，启动基因表达，避免 cGAS 持续过表达造成胚胎死亡。Tamoxifen以玉米油配制，终浓度 20 mg/mL；对实验小鼠采用腹腔注射，单次剂量 100 mg/kg，连续 5 天每日定时给药，稳定激活Cre 组酶，诱导cGAS特异性过表达。

给药后监测小鼠存活、体重变化，按期取材肺、脾等组织。借助染色技术观察肺部炎症与 TLS 结构，通过分子及流式实验检测通路蛋白、细胞因子、免疫细胞表型，同时结合药物干预、细胞转移实验完成功能验证。

图 4.  cGAS overactivation induces pulmonary inflammation.

*本文所述产品仅供科研使用

参考文献

[1] Kim, H.; Kim, M.; Im, S. K.; et al. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory animal research 2018, 34 (4), 147-159.

[2] Machholz, E.; Mulder, G.; Ruiz, C.; et al. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of visualized experiments : JoVE 2012,  (67).

[3] Madisen, L.; Zwingman, T. A.; Sunkin, S. M.; et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. 2010, 13 (1), 133-140.

[4] Zhong, Z. A.; Sun, W.; Chen, H.; et al. Optimizing tamoxifen-inducible Cre/loxp system to reduce tamoxifen effect on bone turnover in long bones of young mice. Bone 2015, 81, 614-619.

[5] Andersson, K. B.; Winer, L. H.; Mørk, H. K.; et al. Tamoxifen administration routes and dosage for inducible Cre-mediated gene disruption in mouse hearts. Transgenic research 2010, 19 (4), 715-725.

[6] Andersson, K. B.; Winer, L. H.; Mørk, H. K.; et al. Tamoxifen administration routes and dosage for inducible Cre-mediated gene disruption in mouse hearts. 2010, 19, 715-725.

[7] Donocoff, R.; Teteloshvili, N.; Chung, H.; et al. Optimization of tamoxifen-induced Cre activity and its effect on immune cell populations. 2020, 10.

[8] Wang, X.; Zhao, L.; Zhang, Y.; et al. Tamoxifen provides structural and functional rescue in murine models of photoreceptor degeneration. 2017, 37 (12), 3294-3310.

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