利用CRISPR-Cas和转座子结合系统在基因组中插入DNA片段

     基因组编辑技术用于哺乳动物及人类疾病治疗无疑是生命科学的重大进步之一，扫描基因组找到特定位置并切断基因组或将效应蛋白带至特定位置是最初基因编辑系统的主要工作。如果把基因编辑看作给基因组进行外科手术的过程，那么，这个外科手术如同只给了术者一把手术刀，切开后需要”患者“（靶细胞）自身的修复功能完成手术。显然，这并不尽如人意。随着碱基编辑技术的发明，如今可以摆脱靶细胞本身对基因编辑效率产生的影响。然而，如何插入较大片段DNA至靶细胞是基因编辑用于疾病治疗面临的又一大难题。基于此，CRISPR-Cas-转座子转座技术结合可能是基因编辑技术日益完善探索中重要的里程碑；尽管令人兴奋，但这条道路仍旧很漫长，仍有许多疑问：如哺乳动物或人类活体脏器细胞的特异性递送；如何避免evoCAST在基因组中产生的零星脱靶插入等。因此，对于该系统的临床应用仍需谨慎行事。

      CRISPR–Cas系统原本为细菌或古生菌的重要免疫工具以防止外来遗传物质的的侵入，人们利用这一系统作为基因编辑工具对人类基因组进行识别并在识别处附近产生DNA双链的氢键断裂产生R—loop再将DNA切断，引致细胞内源性的DNA损伤修复途径（同源重组途径或非同源末端结合）修复切断的DNA从而完成基因组DNA的基因编辑。可见，靶细胞的自身修复过程是重要环节。不同细胞类型DNA损伤修复途径的激活有较大的差异。如同源重组修复依赖于活性细胞分裂，因此有丝分裂后的细胞无法用同源重组修复的方式进行基因编辑，

       如何使基因编辑过程不依赖于靶细胞自身修复系统完成基因编辑，是继CRISPR-Cas用于基因编辑系统发现以来面临的重大课题之一。刘如谦实验室发明的碱基编辑方法便是其中的方法之一。但该方法只是对局部的碱基进行小范围的替换。要像在基因组中插入较大片段进行基因编辑则需另辟蹊径。

       转座子系统可以通过剪切/粘贴的方式可以转移较大的DNA片段至基因组中，转座子最早由Barbara McClintock在20世纪40年代于玉米中发现发现。

以转座子Tn7系统为例，其核心组成成分为杂合转座子酶TnsA 和TnsB和调节因子蛋白TnsC。Tn7转座子另外两个蛋白TnsD和TnsE分别可介导识别attTn7序列（TnsD）和识别复制叉，单链DNA（TnsE)。从而完成转座子的垂直传播（由TnsD介导)和水平传播（由TnsE介导）。

   2017年，Joseph E. Peters通过系统树分析发现Tn7转座子系统与CIRISPR-Cas相关，在其分析的拟似Tn7转座子中（Tn7-like转座子），TniQ扮演了TnsD的角色，并且他们认为，似乎CRISPR-Cas 系统在功能上取代了TnsE。于是提出了在生物学意义上最小CRISPR-Cas变异与可转座元件的关联有利于可转座元件传播的假设。

图1 Tn7转座子（左）与含有CRISPR-Cas系统的Tn7元件的两种靶向途径模式图（右）

左图中当TnsA,B,C蛋白核心元件加TnsD时可以识别基因组中att Tn7位点从而将转座子插入基因组中，实现转座子的垂直传播。而TnsABC加TnsE则可介导以质粒或噬菌体为靶向的转座（水平传播）。

   右图为Joseph E. Peters等提出的模型，模型中拟似TnsD蛋白（TniQ）与TnsABC蛋白所介导的转座途径由TniQ蛋白识别附加位点（attachment site ,attsite),而cas所编码的位置恰好在TnsE编码的位置，很可能在功能上TnsE被Cas所替代，而转座相关的Cas系统CRISPR阵列主要携带质粒和噬菌体的间隔序列（protospacer)，很可能把转座子引导至这些元件。

图片来自Joseph E. Peters等2017

根据这一假设得知，与Tn7转座子相关的cas系统虽然缺乏核酸酶活性，但可以识别特定序列从而引导转座子转座至特定位置。显然，这种假设机制的重点在于Cas系统识别特定位置后并非切割DNA而是引发转座过程。这个过程绕过了需要细胞自身修复的条件。如能实现则可以将较大片段特异地插入基因组中。

       2019年华裔科学家张锋实验室构建了CRISPR相关的转座酶（CAST,CRISPR-associated Transposase), 整个CAST位点约20-25kb长，左端含有拟似Tn7转座子基因，右端含有CRISPR阵列和Cas12k，中间为负荷基因,将其在霍夫曼伪枝藻（Scytonema hofmanni）中培养，再以小RNA测序确定是否该系统中的tracrRNA与crRNA是否能表达，如果能表达说明可与R-loop中DNA结合的RNA(这里指crRNA)应该能工作。

 图2  CAST 结构图（上）及该结构表达tracrRNA及crRNA的检测结果（下）。

     由图2下图可知，与转座子相关的CRSIPR-Cas12K能够表达TracrRNA和crRNA,它们是CRISPR-Cas系统识别R-loop的结构基础。

       图片来自Jonathan Strecker等2019

       随后，他们为观察该CAST系统是否可以作为RNA-引导的转座子发挥作用，即能否将CRISPR-cas识别的转座子转座到质粒中；构建了如图3的系统以观察当pHelper质粒中的TnsB ,TnsC，TniQ,Cas12k蛋白及tracrRNA direct repeat spacer RNA在大肠杆菌表达时是否可以将pDonor中的转座子LE-kanR（人为加入的卡那霉素抗性基因）-RE转座至pTarget 质粒中靶位置PSP1-PAM附近（此时pTarget 变为pInsert)。如果把靶位置换成大肠杆菌中基因组的位置，也应能够实现转座（未显示图）

图 3  在大肠杆菌中，CRISPR –Cas 系统中crRNA可以引导Tn7转座子系统进行转座

在pHelper 质粒中，含有Tn7 转座蛋白TncB,TnsC和TniQ以及CRIPSR-Cas系统成分，包括Cas12k，TracrRNA ,direct repeat ,spacer。pTarget 质粒含有CRISPR-Cas要识别的靶序列包含PSP1和PAM, pDonor 质粒中含有将要转座到pTarget质粒的序列LE-卡那霉素抗性基因（KanR)和RE。把这3个质粒转入大肠杆菌中(16h)后，pDonor中的序列在pHelper 质粒中表达的蛋白和RNA的协助下转座至pTarget中CRISPR靶位置附近，图A 右侧图显示转座后深度测序各元件的位置。

图B显示插入频率及pTarget序列变异对插入频率的影响。

shCAST：S. hofmanni CAST

图片来自Jonathan Strecker等2019

图 4将图3A成分置入试管中（ in vitro）转座后pTarget质粒测序结果，被转座的序列LE-卡那霉素抗性基因（图中以-//-显示）RE位于CRIPSR靶序列（PAM,PSP1）下游。

图片来自Jonathan Strecker等2019

于是张锋实验室提出的与转座子相关的CRIPSR-Cas系统实现依R-loop为特异性位置的转座机制模型如下：

图 5 CRIPSR 引导Tn7转座子系统转座假设机制

含有Cas12k,TnsB，TnsC,和TniQ的shCAST复合物可以介导插入DNA,位置在PAM序列下游60-66bp处，转座子LE和RE序列连同人为加入的负荷基因被插入结果导致5bp插入位置的重复。

图片来自Jonathan Strecker等2019

以上在大肠杆菌中的结果令人鼓舞，但哺乳动物细胞中Cas介导的转座效率很低。

       2025年，另一位华裔科学家刘如谦将转座子相关蛋白TnsA，B.C进行变异，利用噬菌体以演化方式进行筛选，筛选出了具有较高效率转座变异体（约提高200倍以上）；他们将此命名为evoCAST（详见原文）。以此evoCAST 将14个具有治疗潜力的DNA大片段整合入相应位置，整合率最低在10%以上，而野生型TnsA,B的整合率则小于3%。

图6evoCAST系统，该系统用于人类细胞CRIPSR 引导的转座子转座系统，其中的转自相关蛋白TnsC,TnsAB是经过噬菌体演化筛选好的变异体，可以大大提高转座效率。

图片来自Isaac P. Witte等2025 

以TRAC基因为例， 众所周知，TRAC基因编码T细胞表面识别靶细胞的TRC，对于基因治疗中CAR T细胞的制作至关重要。本文中采用evoCAST可以将CD19 CAR 片段（1.7kb）整合入HEK293T细胞中，整合效率可达12%。

图 7使用evoCAST系统可以将CD19 CAR基因（1.7kb）整合入人类基因组中。

图A原理图， 图B使用evoCAST整合CD19（1.7kb）至人类基因组的效率

图片来自Isaac P. Witte等2025 

       细胞基因编辑从起初需要依赖靶细胞自身的修复功能修复到无需依赖靶细胞的修复功能并能进行大片段插入的时间大约经过仅13年时间（2012-2025）,但这些技术背后基础研究则涉及更大的时间范围。如用于CRISPR-CAS技术的理论基础细菌中基因组中重复序列的发现在1989年，对于涉及EvoCAST的基础----转座子的发现则可追溯到更早的20世纪40年代。如此可见，只有在大量的基础研究积累的前提下，新的技术才能以一跃而起的形式产生。这需要研究者们阅读大量前人的文献才能从中寻找灵感。

       出于以特异性大片段插入为主题的目的，本文难以对其中涉及的技术一一加以介绍，例如：如何用噬菌体协助连续演化技术（phage-assisted continuous evolution (PACE)）对TnsA，B进行演化筛选（参考文献 3）等；另外，在本文中刘如谦实验室还插入了可能用于治疗血友病B的F9 cDNA（插入片段3kb）至ALB 内含子1中，其靶向整合效率约5.7%,而血友病B仅需恢复1%的循环人凝血因子IX（hFIX）水平即可得到改善；超出治疗所需校正量。

主要参考文献

1，Joseph E. Peters et al PNAS 2017  dio/10.1073/pnas.1709035114

2， Jonathan Strecker et al Science 2019 365(6488)48-53 doi 10.1126/science.aax9181

3， Isaac P. Witte et al Science 2025 May 15; 388(6748): eadt5199.   

      doi:10.1126/science.adt5199.

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