荧光标记已成为当代生命科学的研究中不可或缺的研究手段之一。目前所用的荧光分子包括蛋白和化学荧光分子。前者有易于采用遗传手段将荧光标签蛋白融合于目的蛋白，以便于目的蛋白的定位或研究蛋白-蛋白之间的相互作用等特点；后者则有荧光强度强、光稳定性及细胞渗透性好的优点，却不能像蛋白荧光分子那样易于以遗传密码的方式关联于特定蛋白分子。

      多年来化学家们做了各种努力，通过改变一些基团不但能使化学荧光分子发出不同颜色；如由罗丹明衍生出的Janelia Fluor® (JF)，是一系列可发出不同荧光的化学分子；并且开发出一些可结合化学荧光分子的蛋白标签，如： HaloTag和SNAP-tag。 然而，这些蛋白标签分子量较大（约含297个氨基酸残基），挂在目标蛋白上很容易产生空间位阻，影响目标蛋白原本的正常功能或定位。另一缺点是单个标签只能结合相应的一种荧光染料，难以做到同时应用多重荧光。

       人工智能蛋白从头设计技术可针对荧光染料分子空间结构设计出严密符合荧光分子空间几何特征的蛋白“口袋”。如可发出不同荧光的染料JF657（远红光 ~657 nm）,JF596（橙红光~596 nm）和JF494(绿光 ~494 nm）的分子母核非常相似，目前尚未发现可以结合这三种染料的天然蛋白，且用传统方法很难找出匹配度很高的蛋白结合标签。而人工智能蛋白从头设计技术可以分辨其分子空间几何差异设计出针对这些荧光染料的不同标签蛋白，David Baker 将其称为Navo tag。这样，研究人员可以将不同颜色的荧光分子标记在不同标签蛋白，如此可以同时观察多个不同的，且互不干扰的荧光信号，且这些信号强于荧光蛋白。这些novo tag标签蛋白还具有分子量小（约为Halo tag的1/3)，空间位阻小，对宿主细胞干扰小的特点。采用人工智能从头设计技术还可以设计出拆分（split)的标签蛋白，使其拆分为独立的 片段A和片段B,这两个单独存在时并不与染料结合（或无荧光增强）；当特定的染料存在时可触发两者在空间上靠近结合，配体结合口袋被重新还原并结合染料发出荧光。 这种蛋白拆分系统适合于活细胞内蛋白-蛋白之间相互作用的研究。

主要参考文献:

Long Tran et al Science 2026 aeb0822 

图1 利用人工智能可以设计出针对具有相同内核、结构差别小的JF657,JF596和JF494荧光分子的结合蛋白(图a,b,c)，由于这三个荧光分子激发光(右图虚线）和发射光谱（右图实线）之间并不重叠，这就为多重荧光同时检测提供了了条件。

图片来自David Baker 2026

图2 结合荧光分子的蛋白在细胞内定位检测

      不同荧光分子JF657、JF596和JF494结合蛋白分别与线粒体、细胞核内膜(inner nuclear membrane)及内体（endosome)标记蛋白融合（图A），然后观察荧光信号在Hela细胞中的分布（图B）。 图C，D显示JF657结合蛋白拆分出两个片段后被JF657荧光分子诱导重新组成完整的JF657结合蛋白并与JF657结合的实验设计和结果。图C显示JF657结合蛋白拆分为两个片段后可受JF657分子的诱导形成可以结合JF657荧光分子的完整蛋白并与之结合模式图。图C中方框内为实验设计的质粒结构图，图中可见P2A为表达为蛋白后可被酶切断的位点。切断后的两个片段分别为mitoTag（线粒体标记蛋白）-mScarlet(可发出红色荧光的荧光蛋白）-JF657的拆分片段A和JF拆分片段B-mNeon Green（绿色荧光蛋白）两个融合蛋白；前者可以看作实验的阳性对照（因为线粒体标签-红色荧光蛋白融合，在细胞内应该分布在线粒体位置）,后者可以看作阴形对照（只有绿色荧光蛋白与拆分片段B融合，在细胞中应该随机分布）。当加入JF657时，就诱导JF657结合蛋白拆分片段A 和B结合成完整的结合片段并与JF657 结合。形成如图D的结果。图D中上一行是未诱导（无JF657加入）时与线粒体mitoTag标签融合的mScarlet发出的红色荧光分布于线粒体位置，而绿色荧光（mNeonGreen)则随机分布于整个细胞，此时JF657通道检测不出荧光。当加入JF657时可以诱导拆分片段A 与B结合形成完整的JF657结合蛋白并与JF657结合，形成完整融合蛋白与JF657复合物。此时mNeonGreen信号由随机分布转成依线粒体位置分布，（中间mNeonGreen通道）,且JF657通道（右）也看到了根据线粒体位置而分布的信号。

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