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期刊：Grassland Research（草地研究）

中文标题：低温下四种温带豆科牧草结瘤动力学差异根瘤菌的筛选
第一作者：Emmanuelle D'Amours（加拿大农业及农业食品部,魁北克研究与发展中心）
通讯作者：Annick Bertrand（加拿大农业及农业食品部,魁北克研究与发展中心）

编译者：楚孟娇 兰州大学草地农业科技学院 在读博士生
说明：该文仅代表编译者对论文的理解，如需参考和引用相关内容，请查阅原文。

摘要
背景：冬季气候变化，包括频繁的冻融事件和浅积雪，将对多年生作物的春季再生产生重大影响。已培育出的适应严冬条件生长，且不会诱发鼓胀病的多年生豆科牧草，包括红豆草、百脉根、红三叶和杂三叶。与此同时，选择耐寒根瘤菌菌株可以使共生氮(N)更早固定，从而促进春季豆科植物的再生。
方法：为了鉴定出快速形成结节且表现高固氮潜能的菌株，在春季土壤温度下，对60株与4种温带豆科植物相关的根瘤菌进行了为期11周的根瘤形成动力学、固氮酶活性和寄主产量的评估。
结果：随着时间的推移，菌株在豆科寄主上形成有效根瘤的能力不同。氮酶活性较高的菌株为红豆草的北极菌株N10和百脉根的菌株L2。而在三叶草中，对照植株和接种植株的氮酶活性相似，可能是由于种子中存在的内生根瘤菌在对照植株中形成了有效的根瘤。
结论：根据低温下结瘤动力学、氮酶活性和产量进行筛选，可以有效地鉴定豆科作物的根瘤菌性能。使用耐寒菌株有助于缓解冬季气候变化。
关键词：耐寒根瘤菌；百脉根；低温；红豆草；根瘤菌；共生；杂三叶；红三叶

引言
在加拿大，以苜蓿为主的饲草作物的种植面积非常可观，达3亿公顷。牧草富含纤维和，能量与蛋白质含量均衡，能很好地满足反刍动物的营养需求。众所周知，多年生豆科植物因其共生固氮(SNF)能力和长期发展的持久力而有助于可持续农业的发展(Houde et al., 2020; Khatiwada et al., 2020; Peoples et al., 2019) 。在混合饲料中添加多年生豆科牧草，由于其共生固氮能力，可以以最小的投入增加这些饲料的蛋白质含量，从而降低了对化石来源肥料的依赖。
一些饲料豆科植物蛋白质含量高的缺点是这些蛋白质的不稳定性。以紫花苜蓿(Medicago sativa L.)为例，蛋白质的高消化率可能导致反刍动物的泡沫性鼓胀，这是由植物细胞在进入瘤胃后迅速裂解和释放蛋白质造成的。一些含有浓缩单宁或高浓度多酚氧化酶的豆科植物可以减少蛋白质的瘤胃降解率，从而降低鼓胀病的发生，同时减少反刍动物对甲烷和氨排放(Kelln et al., 2020; Sheppard et al., 2019; Winters & Minchin, 2001)，同时支持类似的动物生产性能。其中一些品种是温带豆科牧草(Frame et al., 1998)，非常适合在北方国家生长。例如，红豆草(Onobrychis viciifolia Scop.)耐寒耐旱；百脉根(Lotus corniculatus L.)具有水分利用效率高的特点；红三叶(Trifolium pretense L.)和杂三叶(Trifolium hybridum L.)适应寒冷气候以及排水性差的酸性土壤。
北部地区的肉牛生产者重新聚焦在其牧场里引入更多豆科牧草，以提高其营养价值，同时避免放牧的反刍动物出现鼓胀病的风险。因此，育种者投入了大量精力来提高这些非鼓胀豆科植物在寒冷条件下的产量和持久性（Acharya, 2015; Wang et al., 2015）。多年来，新品种被开发出来并被牛肉生产商采用（Acharya, 2015；Martin et al., 1999；Papadopoulos et al., 2008）。为了充分发挥新开发的遗传材料的产量潜力，需要进行并行研究，为这些物种提供有效的接种菌，这些接种菌同样能适应寒冷的气候，并能在寒冷的土壤中有效地结瘤和固氮。北方地区这些饲用豆科植物缺乏耐冷接种菌是一个严重问题，因为土壤温度低抑制了共生固氮，是导致多年生豆科植物春季再生时生长期延迟的主要原因（Zhang et al., 2020）。
寒冷的环境会对根瘤菌和豆科植物的生存产生负面影响，并阻碍共生固氮的建立及其效率(Atieno & Lesueur, 2019; D'Amours et al., 2022; Prévost & Bromfield, 2003; Yuan et al., 2020)。根瘤菌生长和固氮的最佳温度在 20°C 至 30°C 之间(Bordeleau & Prévost，1994）。这远高于春季植物再生时的土壤温度(Jégo et al., 2014)。由于土壤低温会降低结瘤和固氮酶活性，从而推迟豆科饲草的春季再生(Bordeleau & Prévost，1994；Yuan et al., 2020)。在北方气候下，早期建立共生固氮将非常有利，可以减少施氮量并缓解胁迫。这些问题比以往任何时候都更加重要，因为冬季的气候变化导致频繁的冻融事件和更长的没有隔热积雪的时间，这两种情况都造成冰冻穿透土壤，从而对多年生器官造成损害并扰乱土壤微生物，进而延迟或抑制春季再生。
耐胁迫根瘤菌菌株与宿主植物的互作，已被证明可以在豆科植物逆境条件下的生长和存活方面具有协同优势。例如，适应寒冷的根瘤菌菌株的使用已被证明可以提高紫花苜蓿的越冬和再生潜力(Bertrand, Prévost, Bigras, Castonguay, et al., 2007; D'Amours et al., 2022; Prévost & Bromfield, 2003）。在以耐盐性为重点的研究中发现，耐胁迫紫花苜蓿品种和耐胁迫根瘤菌的结合，会导致豆科植物在盐胁迫条件下生长和存活的协同能力 (Bertrand et al., 2015, 2016) 。在高二氧化碳浓度下种植紫花苜蓿和大豆时发现，一些根瘤菌菌株适应了高的二氧化碳浓度，并且可以在气候变化的条件下提高宿主植物的产量 (Bertrand et al., 2011; Prévost et al., 2010) 。
我们必须利用这些协同优势来选择耐寒株系，以减轻气候变化对多年生作物春季再生的负面影响。从这个角度来看，加拿大农业与农业食品部(AAFC)拥有过去50年来从加拿大、美国北部以及其他国家和地区收集的大量根瘤菌菌株 (Prévost & Bromfield, 2003)。这些菌株包括从定殖在红豆草、三叶草和百脉根中分离出的根瘤菌，以及从加拿大高纬度北极地区本土豆科植物中分离的北极根瘤菌菌株，这些菌株可以定殖在红豆草中并在极冷环境下固氮(Prévost, Bordeleau et al., 1987）。
本研究的总体目标是鉴定出与无鼓胀豆科植物相关的，能够有效地结瘤并固氮的冷适应根瘤菌菌株。更准确地说，这项研究将使我们能够恢复和增加根瘤菌菌株的收集，并确定出红豆草、百脉根、红三叶和杂三叶在低温下互作最好的菌株。

材料和方法
首先，对AAFC收集的根瘤菌进行活化，并对每个菌种的生活力进行评估。然后，对根瘤菌菌株与红豆草、百脉根、红三叶和杂三叶（表1）的冷适应品种之间的所有互作组合进行筛选，以了解其在18°C/16°C（白天/夜间）春季温度下的结瘤动力学，代表加拿大春季土壤温度（图 S1a,b）。经过第一次筛选，在试管中鉴定出低温下表现出良好结瘤的菌株，并将与所选菌株相关的每种豆科植物种植在盆中，通过测定每个组合和未接种对照植株的氮酶活性来测定产量和菌株的固氮潜力，以确定表现最佳的菌株。

表1 本研究使用的根瘤菌菌种鉴定，其寄主植物和采集地点，来源及参考

注：所有菌株都与它们分离出来的特定寄主植物进行了互作测试，除了与红豆草互作的菌株外，据报道它们的寄主范围更大(Prévost, Bordeleau, et al., 1987)。
来源：AAFC，加拿大农业与农业食品部，魁北克市，魁北克州，加拿大；INRA，法国国家农业研究院，第戎，法国；Nitragin公司，密尔沃基市，威斯康星州，美国；UCDA，美国农业部，根瘤菌培养收集，贝尔茨维尔农业研究中心，贝尔茨维尔，马里兰州，美国。

植物材料

本研究中的四种豆科植物的栽培品种是从AAFC育种计划中获得的，因此适合在北欧国家生长。参试豆科植物为红豆草(O. viciifolia subsp. viciifolia cv. Mountainview; Acharya, 2015), 百脉根 (L. corniculatus cv. Bruce; Papadopoulos et al., 2008), 杂三叶 (T. hybridum cv. CRS111, 种子由AAFC的Papadopoulos博士友情提供), 红三叶 (Trifolium pratense cv. Christie; Martin et al., 1999)。每个豆科植物品种都配以相容的根瘤菌，在试管中评估其低温下的结瘤能力。

活化菌株的收集及新菌株的分离

对在AAFC -80°C下长期保存的56个根瘤菌菌株进行活化。其中24个菌株（包括 8个北极菌株）是红豆草特有的，7个是百脉根特有的，24个是红三叶和杂三叶特有的（表1）。北极菌株能够在酵母提取物甘露醇(YEM)培养基中在 5°C 下生长，之前的报道中仅使用红豆草进行了测试(Prévost, Antoun et al., 1987; Prévost, Bordeleau et al., 1987)，结果表明北极根瘤菌具有与红豆科相关物种（如红豆草）特有的交叉感染模式。北极菌株是从加拿大高纬度北极地区收集的高山黄芪(N31)、阿克托比亚棘豆(N33、N47)和梅德利亚棘豆(N3、N10、N15、N17、N40)中分离出来的(Prévost, Bordeleau et al., 1987)。
为了使其恢复活力，每个菌株都在酵母甘露醇琼脂平板上生长(Prévost、Bordeleau et al., 1987; Vincent, 1970)。为了产生每种菌株的纯接种物，将单菌落转移到 15 mL 试管中的酵母甘露醇肉汤 (YMB) 中，然后置于振荡培养箱（120 rpm，Lab-Line Orbit Environ-shaker）中，北极菌株25°C培养，温带菌株28°C培养。这些生长温度是基于这些菌株的最适生长温度确定的；耐冷的北极菌株的最适生长温度为25°C，嗜温的温带菌株的最适生长温度为28°C (Cloutier et al., 1992)。然后，取 6 mL 对数中期培养物与等量的 50% 甘油混合，并保存在 4°C。子样品保存在-20°C下长期储存。
活化后，从所集菌株中保留了51个菌株用于研究。从百脉根(EDA_LO)、红三叶(EDA_TR1, EDA_TR2)和杂三叶(EDA_TA)的根瘤中分离出来的新菌株，也用于后续研究中，总共测试了 55 个菌株。


试管中结瘤效率

在这项持续11周的试验中，用红豆草试验24株，用百脉根试验7株，用红三叶试验24株，用杂三叶试验24株。对于每个物种，试验中还包括未接种的对照。对于这79个组合，每周每种采集10个试管，持续8周（从第4周到第11周），总共6320个试管。为了限制同时评估的材料，每个植物物种都按顺序进行处理。对各品种种子表面进行消毒，95%乙醇浸泡30s，3% NaClO浸泡2次，每次2 min，然后用无菌水清洗3次。种子置于1.5% (1.5 g/100 mL) 琼脂培养皿中，室温下黑暗孵育3天。将发芽的幼苗无菌转移并生长在含有约20 mL 蛭石和20 mL无氮Hoagland溶液的200 mm × 25 mm无菌加盖管中，并放置在以下温度条件的生长室（Conviron型号PGW40）中：18°C /16°C（白天/夜间），500 µmol m-2 s-1 光合光子通量密度下的 16 小时光周期，以模拟加拿大春季融雪后日长及土壤温度条件(图S1a,b；Castonguay et al., 2009)。我们希望将植物/菌株互作暴露于春季土壤温度下，因为春季是共生的关键季节，在此期间，共生固氮必须迅速恢复，以便在不施氮的情况下第一次收获时获得良好的饲草产量。这些昼夜温度的选择也基于Prévost 和 Bromfield (1991)的报告，即15°C 左右的根部温度适合温带和北极菌株结瘤。
除未接种的对照外，5日龄幼苗均接种1 mL 108细胞·mL−1的测试菌株。实验期间未重新打开或浇水管盖。在接种后的第4周和第11周之间，每种豆科植物菌株互作组合每周取样10管。基于预实验确定实验的持续时间，红豆草根瘤形成发生在第4周，在第9至10周左右达到平台期。记录有效结节（粉红色和有活力的）的数量(Vincent, 1970)。
考虑到各菌株结瘤模式的重要参数，将根瘤计数分为四个步骤：(1)在第4周形成根瘤的最快菌株；(2)第11周时的根瘤数量；(3)第4周至第11周形成根瘤的总体平均数；(4)每个植物物种的选定菌株从第4周到第11周的根瘤形成动力学，使用根瘤数量作为响应变量计算的线性回归。比较斜率来检验结瘤效率的差异。用线性回归表示每周的根瘤数。

盆栽植物氮酶活性及产量测定根据试管试验的结果，选择每种豆科植物在低温下表现出良好结瘤潜力的菌株，以进一步评估固氮酶活性和生物量。红豆草中所选菌株为温带菌株116A17和USDA3172，以及北极菌株N10；百脉根菌株为EDA_LO、L2和MSDJ865；红三叶菌株为EDA_TA、TL3、TL8 和USDA2046；以及杂三叶菌株EDA_TR2、IAT160和TL8。
在本实验中，将10颗表面灭菌的预发芽种子播种在直径14厘米的花盆中，盆中装有土壤：沙子：硅石的6:2:2 (v:v:v)混合物。每个宿主菌株互作组合使用5个花盆，以及每种豆科植物的接种对照，总共85盆，每盆10株植物。植物在上述光照和温度条件下的生长室中培养。盆栽植物每天浇水，至水通过重力从盆中排出，不施肥。生长1周后，每盆10株植物每株接种0.5mL含有108细胞·mL−1的接种菌剂。对照植物接种0.5 mL灭菌的YMB。
生长5周后，通过测量封闭在气密塑料袋中的盆栽植物的固氮酶活性，来测试上述宿主菌株互作组合以及未接种对照的固氮能力。这种方法适合比较未受干扰的结瘤豆科植物不同组合下的体内固氮酶活性。即使通过这种方法获得的数据不能反映固氮酶可以固定的确切氮量，也足以比较出盆栽植物在不同根瘤菌处理下的最小干扰(Bertrand, Prévost, Bigras, Lalande et al., 2007)。这个简单的试验最近被证明可以重复评估植物伴生细菌的固氮酶活性(Haskett et al., 2021)。
固氮酶活性通过乙炔还原试验测定，使用装有橡胶隔膜的密封塑料袋（体积为 10 L）的罐子(Prévost & Bromfield, 2003)。将装有盆栽植物的塑料袋密封，通过使用气密的60 mL注射器通过隔膜注入纯MS级乙炔（每袋注射14次），将10%的体积(1 L)替换为乙炔(C2H2)。立即对每个袋子中的空气进行采样（初始时间为 0），然后在孵育30分钟、1小时和2小时后采集空气样本，通过该酶将乙炔还原为乙烯(C2H4)来建立固氮酶活性的动力学曲线。计算每盆每小时浓度的平均增加量，并用µmol C2H2 h−1表示固氮酶活性，考虑试验体积为9 L（盆栽植物占据1L），摩尔体积为 23.8 L ·mol−1。对于所有互作组合，也给出了以采样时间为自变量的线性回归曲线。
为了防止样品降解，立即使用丙烯注射器（20 mL；Becton Dickinson）将空气样品注入预先抽真空的小瓶（12 mL Exetainer；Labco）中。通过气相色谱法（型号3800；Varian Inc.），并使用两个串联色谱柱：HayeSep A 和硝酸镍(10%)催化剂色谱柱 (Chromatographic Specialties)，分析空气样品中的乙烯(C2H4)的浓度。烘箱温度设置为60°C，载气（氦气）流量设置为35 mL·min−1。如Bertrand、Prévost、Bigras、Castonguay等人所述，C2H2可在300°C 时在火焰电离检测器上检测到（2007）。
通过收获地上生物量来测定接种了所选菌株的每种豆科植物以及未接种的对照植物的产量。为此，每盆植物刈割高度为1，在55°C下干燥48小时。记录干重（DW），宿主-菌株互作组合的产量以每盆的g DW表示。

统计分析

对于结瘤，使用 Excel 进行方差分析 (ANOVA)，比较均值和作图来分析处理(Klasson，2020)。方差分析的结果使用SAS 9.3 2012版(SAS Institute Inc.)的GLM程序进行验证。数据采用完全随机区组设计，采用单变量方差分析来研究菌株对第4周和第11周结瘤数量，第4周至第11周结瘤数量的总体平均值的影响，以及线性回归的斜率表示的结瘤增加量（图 S2-S4）。当不满足正态分布和等式假设时，使用log10(x + 1)变换。在这个方程中加1将“0结瘤”转换为1，然后在数据进行对数转换时返回为0。当方差分析中 处理间差异显著（p < 0.05）时，使用Fisher LSD进行均值比较。这种易于使用的方法使用动态电子表格来执行标准方差分析和计划外多重比较程序，并使用 SAS 软件进行验证。使用R软件的ggPredict 函数，和具有重复测量（周）的混合模型，从结瘤数量的拟合平均值获得线性回归斜率。
对于固氮酶活性和产量，采用SAS的GLM程序进行完全随机区组设计，当处理间差异显著（p < 0.05）时，使用Fisher LSD进行均值比较。使用R软件的ggPredict函数对每个采样时间的固氮酶活性进行均值预测，获得线性回归曲线。

结果
收集菌株的共生固氮能力

大多数活化的菌株（56株中的51株）可以在YMB上重新生长，并在低温下保持其 共生固氮的能力，即使在-80°C的20%甘油中保存数年后也是如此。在低温条件下（18°C/16°C，白天/夜间），51个菌株中仍能形成有效结瘤（粉红色结瘤）的菌株数量为35个（68%）。如果结瘤试验在较高温度下进行，可有效结瘤的菌株的数量可能会更高。这一结果证实了收集菌种保存方法的有效性以及根瘤菌菌株与其宿主的长期共生能力。

试管中结瘤

在 18°C/16°C 的昼/夜温度条件下，大多数豆科植物-菌株组合在第4周至第11周都发现了根瘤的存在（表2-4），并且不同接种菌株的结瘤数量有显著差异。在所有采样日期，所有菌株/寄主植物互作的未接种对照均未形成根瘤。在与某些菌株互作的一些豆科植物寄主中，从第4周到第11周以及所有重复中都没有发现结瘤（表2和4）。对于大多数豆科植物菌株互作，随着时间的推移，观察到每个根系的根瘤数量呈线性增加。然而，每个植物物种的根瘤菌菌株之间的增加幅度存在显著差异（图1a-d）。红豆草每周根瘤数量的增加范围为0.5 - 2.7个（图 S2），百脉根为0.9 -2.0个（图 S3），红三叶为1.6- 3.3个，杂三叶为2.0 - 4.4个（图 S4）。所有的根瘤菌菌株-豆科植物组合，在低温条件下均没有观察到明显的根瘤衰老。对于每个豆科植物，测量的固氮酶活性和产量与一些高性能菌株相关，这是因为这项任务是劳动密集型且耗时的。菌株的选择基于以下结瘤模式的一个或多个参数：快速结瘤（第4周的结瘤数量）、第4周和第11周之间结瘤数量的增加以及每周结瘤数量的增加。

表2 红豆草第4周和第11周时每株植物每个根系的平均根瘤数，以及与其相关的每个菌株从第4周到第11周的平均根瘤数。

注：由于 log10(0) 未定义，因此在分析前使用 log10(data + 1) 转换数据。每个值是10个管的平均根瘤数，每管一株植物。同一列中的不同小写字母表示使用 Fisher's LSD 检验确定的p < 0.05，即存在显著差异。当10个管的平均结节数为无结节时，相应菌株被排除在所述周（即第4周）的统计分析（ANOVA）之外。在整个实验过程中未诱导根瘤形成的菌株 USDA3348、116A15、AA1、AA2、116A12 和 N17 被排除在统计分析和表 2 之外。
缩写：ANOVA，方差分析；LSD，最小显著性差异；NN，没有结节。

表3 百脉根第4周和第11周时每株植物每个根系的平均根瘤数，以及与其相关的每个菌株从第4周到第11周的平均根瘤数。

注：数据在分析前使用log10(data + 1)进行转换。每个值是10个管的平均根瘤数，每管一株植物。同一列中的不同小写字母表示使用 Fisher's LSD 检验确定的 p < 0.05，即存在显著差异。
缩写：LSD，最小显著性差异；NN，没有结节。

表4 红三叶和杂三叶第4周和第11周时每株植物每个根系的平均根瘤数，以及与其相关的每个菌株从第4周到第11周的平均根瘤数。

注：数据在分析前使用log10(data + 1)进行转换。每个值是10个管的平均根瘤数，每管一株植物。同一列中的不同小写字母表示使用 Fisher's LSD 检验确定的 p < 0.05，即存在显著差异。菌株 3D1K5（杂三叶）、TL11、RL3、RL2、R39、FH-345K、FH-20-S1、FH-134-S、FH-131-Sp 和 FH-13 在整个实验过程中未诱导根瘤形成，被排除在统计分析和表4之外。
缩写：LSD，最小显著性差异；NN，没有结节。

图1 对于 (a) 红豆草、(b) 百脉根、(c) 红三叶和 (d) 杂三叶的选定菌株，第4周至第11周的根瘤形成动力学的线性回归。使用R软件的ggPredict函数，通过重复测量（周）的混合模型的预测均值获得斜率。

对于红豆草，产生根瘤速度更快的温带菌株是116A17、USDA3140和USDA3172，在第4周时已经出现了3-5个根瘤，而最快的北极菌株是 N10，有1个根瘤（表2）。在第11周，相同的温带菌株每个根系产生了超过13个根瘤，从第4周到第11周，每个根系平均产生了9个或更多的根瘤。北极菌株N10在第11周每个根系产生了11个根瘤，并且从第4周到第11周，每个根系平均有6个根瘤（表2）。温带菌株116A17、USDA 3173和USDA3172 以及北极菌株N10随着时间的推移，根瘤数量的线性增加最高，每周增加超过2-2.5个（图 1和图S2）。选择菌株116A17、USDA 3172和N10来评估固氮酶活性和产量，菌株USDA 3172具有快速结瘤的潜力（第4周已形成的根瘤数量），菌株116A17和N10在第4周至第11周根瘤数增加较多。
对于百脉根，七个菌株在4周内都产生了根瘤，并且一些菌株在4周内产生的根瘤明显多于其他菌株。这些快速结瘤菌株包括USDA3471、L2、MSDJ865和百脉根的新分离菌株 EDA_LO，它们在第4周产生了3个以上的结瘤（表 3）。菌株 MSDJ865和EDA_LO 在第 11周具有最多的根瘤数量，并且从第4周到第11周的平均根瘤数量显著增加。随着时间的推移，菌株 EDA_LO、MSDJ865、L2 和 L3根瘤数量线性增加，每周增加1.5-2个（图1和图S3）。对于百脉根，选择用于产量和固氮酶活性测量的菌株是菌株EDA_LO和 MSDJ865，这两个在第4周至第11周平均结瘤数最多，L2菌株结瘤最快。
将 24 株根瘤菌接种到红三叶和杂三叶草（表4）。无论三叶草宿主物种如何，一些菌株在4周内产生的根瘤明显多于其他菌株（表4）。同样，对于两种三叶草来说，产生少量根瘤甚至不产生根瘤的菌株是相似的。菌株EDA_TR2和EDA_TA是红三叶 (EDA_TR2) 和杂三叶 (EDA_TA) 的两个新分离株，是使两种三叶草结瘤的最佳菌株之一。从红三叶中分离出的菌株EDA_TR1在两种三叶草上仅产生少量根瘤。
对于红三叶草，有15个菌株产生根瘤，其中9个菌株在第4周产生超过10个根瘤，而13个菌株在第11周每个根系产生超过20个根瘤（表4）。菌株TL8和IAT160的新增根瘤数高于3个/周（图1和图S4）。因此，对于固氮酶活性和产量评估，根据第4周至第11周的平均根瘤数，选择菌株USDA2046和TL3，根据每周根瘤数的增加选择菌株TL8。还测试了从杂三叶中分离出的新分离株EDA_TA，因为它诱导两种三叶草相对快速的结瘤（第4周）。
对于杂三叶，在第4周，结瘤速度最快的菌株是TL10和ATCC14480，每个根系分别有超过9个和7个根瘤（表4）。然而，在第11周时，有几个菌株每个根系产生了超过20个根瘤，并且包括EDA_TR2、TL4、TL5、TL6和TL8在内的三个菌株每个根系产生了超过30个根瘤。平均而言，菌株 TL10、EDA_TR2、IAT160、TL8 和 EDA_TA 在第4周至第11周期间产生了超过15个根瘤。菌株 IAT160、包括 TL8 和 EDA_TR2 在内的几种 TL 菌株，每周增加的根瘤数量较多（图1和图S4）。用于固氮酶活性和产量测定的菌株为从红三叶根系分离的新菌株EDA_TR2和TL8、IAT160。这三种菌株在第11周均有大量的根瘤，并且每周根瘤数量均大幅增加。

盆栽固氮酶活性

生长 5 周后，对于每个物种，我们观察到处理菌株和未接种对照之间固氮酶活性存在显著差异（图2）。对于红豆草，未接种对照植物的固氮酶活性显著低于接种植物。北极菌株 N10每盆每小时 C2H4 产量最高，平均为 68.5 µmol C2H4 h−1 pot−1，其次是菌株116A17（36.5 µmol C2H4 h−1 pot−1）、USDA3172（27.1 µmol C2H4 h−1 pot−1) 和未接种的红豆草 (0.35 µmol C2H4 h−1 pot−1; 图 2a)。对于百脉根，未接种对照的固氮酶活性显著低于测试菌株。菌株L2 比其他两个菌株产生更多的C2H4，并且所有菌株（L2、EDA_LO 和 MSDJ865）比未接种的对照产生更多的 C2H4（图 2b）。对于杂三叶，菌株EDA_TR2和未接种对照的固氮酶活性显著高于菌株IAT160。菌株TL8的固氮酶活性与其他处理没有差异（图 2c）。对于红三叶，菌株TL8、TL3和EDA_TA的固氮酶活性显著高于菌株USDA 2046。未接种对照的固氮酶活性与菌株处理没有差异（图2d）。

图2 接种各种根瘤菌菌株并封装在气密袋中的(a) 红豆草、(b) 百脉根、(c) 红三叶和 (d) 杂三叶的整个盆栽植物的固氮酶活性。实验中还包括每种植物物种的未接种对照。通过固氮酶将乙炔 (C2H2) 还原成乙烯 (C2H4) 来评估固氮酶活性。0.5、1和2小时后对袋中的空气进行采样。给出的结果是每盆（直径为14厘米，每盆包含10株植物）每小时（平均超过2小时）C2H4 (μmol) 浓度的增加。不同的字母代表菌株之间的差异显著，使用 Fisher 最小显著差异检验确定 p < 0.05。误差线代表标准误差。

以 30 分钟的间隔测量 C2H4 的浓度，C2H4 浓度增加的动力学（以 μmol mol−1 pot−1 为单位）表明，对于大多数菌株来说，在C2H2 存在的情况下，C2H4 浓度的增加在气密袋中的第二个小时相比第一个小时更明显（图3a-d）。

图3 在装有各种根瘤菌菌株单独接种或未接种（对照）的(a) 红豆草、(b) 百脉根、(c) 红三叶和 (d) 杂三叶的气密袋中，0.5、1和2 小时后测量乙烯 (C2H4) 浓度(µmol mol−1 pot−1)。使用R软件的ggPredict函数对混合模型进行均值预测来获得曲线。每条线的颜色对应于一种特定的菌株。不同字母代表封闭2小时后菌株之间的显著差异，使用 Fisher 最小显著差异检验确定 p<0.05。每个值都是五个盆的平均值 ± 标准误差（每条曲线上方和下方的彩色阴影）。

盆栽植物的产量

对于红豆草和百脉根，所有菌株的产量相似。然而，这两种植物未接种对照的产量均低于接种植物（图 4a、b）。与菌株EDA_TR2和IAT 160以及未接种的对照植物相比，接种菌株TL8的植物的杂三叶产量明显更高（图 4c）。对于接种USDA 2046和TL8的植物，红三叶的产量较高（图 4d）。接种TL3和EDA_TA的植物具有中等产量，而未接种的对照植物具有较低产量，但与菌株EDA_TA和TL3没有显著差异。

图4 接种根瘤菌菌株和未接种对照对在盆中生长5周的(a) 红豆草、(b) 百脉根、(c) 杂三叶和 (d) 红三叶的地上生物量（干重）的影响。不同的字母代表菌株之间的显著差异，使用 Fisher 最小显著差异检验确定 p < 0.05。误差线代表标准误差。

讨论

本研究报告了一种评估四种豆科饲草相关的耐冷根瘤菌菌株的有效方法。这种简单的方法可以适应大多数环境条件，以评估受控条件时不同温度下的结瘤动力学。在这里，第一个选择标准是通过每周的结瘤数来评估低温下有效的结瘤形成。第二个标准是基于固氮酶活性的菌株的固氮潜力，而第三个标准是通过测量与每个菌株相关的每个物种的地上生物量来评估产量。这些标准是与共生固氮直接相关的差异性状(Bourion et al., 2018)，并且都受到低温的影响。本研究中应用的方法涉及四种豆科植物和一种非生物胁迫：低温。然而，值得一提的是，这种方法同样可以应用于其他豆科物种响应其他胁迫，如伴随气候变化的高温、二氧化碳浓度升高，盐化，或者在某种控制条件下掺入营养液中的有害化合物。
每个互作组合在18°C/16°C（白天/夜间）温度下形成的根瘤数量是需要考虑的主要因素，因为互作双方都受到了低温的影响，限制了植物(类黄酮分泌)和细菌共生伙伴(结瘤因子的生物合成)之间特定信号分子的交换，从而减少根瘤的数量和大小 (Duzan et al., 2006; Prévost, Drouin et al., 2003)。在这项研究中，一些豆科植物宿主从第4周到第11周仍然没有形成根瘤或根瘤数量较少。对于这些组合，可以推测互作在低温下不是最理想的，并且这些豆科植物-菌株没有进一步结合。然而，由于该研究是针对每个物种使用单一品种进行的，并且由于不能排除特定菌株-品种反应的存在，因此不能排除每种菌株可能与其他品种产生不同的结果。一些菌株能够形成有效的根瘤，并且根瘤的数量随着时间的推移呈线性增加。一些菌株诱导根瘤形成的速度比其他菌株更快，导致每周根瘤数量增加的更大，这表明一些植物-微生物组合比其他菌株更能耐受低温在低温（例如春季土壤中遇到的低温）。
植物-微生物互作在胁迫下的成功取决于多种因素。对微生物来说，根际温度影响土壤中根瘤菌的存活、根瘤的形成以及两个共生伙伴之间分子信号的交换(Sadowsky, 2005)。低温下土壤中自由生活细菌的生存涉及对冬季低温及冷冻引起的土壤干燥的直接抵抗力。许多基因在应激反应期间上调，并且它们的转录水平在耐受菌株中表现出较高，包括参与胞外多糖合成以及 DNA 和 RNA 修复和稳定的基因(Atieno & Lesueur, 2019)。例如，据报道，我们研究中使用的北极菌株在低至-10°C的生长温度下合成冷休克蛋白（CSP）(Cloutier et al., 1992)，并且这些CSP被证明可以与核酸结合，从而使翻译过程中的信使RNA更稳定 (Drouin et al., 2000)。越冬的能力并不能保证春季结瘤的进一步成功，因为低温会延迟结瘤的形成和氮的固定(Graham,1992)。在大豆中，结瘤和固氮能力在25°C至17°C之间随着土壤温度的降低而线性下降，并且在温度低于17°C时几乎停止(Zhang, 1995)。结瘤延迟可能是由于结瘤因子的减少(Duzan et al., 2006) 或低温下根瘤菌粘附到豆科植物根部时受到抑制。就其本身而言，低温对酶活性或豆血红蛋白合成的直接影响可以减少固氮，这与已报道的高温下的情况类似(Hungria & Franco, 1993)。耐受菌株可能有能力通过结合一种或多种保护机制来规避这些低温抑制。对植物来说，从根部释放的黄酮类化合物通过吸引相容的根瘤菌并刺激其产生结瘤因子来启动与细菌的相互作用。根受体感知结瘤因子，诱导下游信号，例如启动根瘤发育的转录因子(Ferguson et al., 2010)。据报道，除类黄酮外，根合成的糖和游离氨基酸也发挥着根瘤菌化学引诱剂的作用(Cooper, 2004)。已有文献表明，秋季低温引发的植物冷驯化过程改变了多年生豆科植物基部和根部糖和氨基酸的积累(Bertrand et al., 2020)，因此改变了根际的化学成分。可以假设，由此产生的冷诱导的改良互作将有利于某些植物菌株产生互作，同时抑制其他植物菌株互作。通过观察耐胁迫根瘤菌菌株与耐胁迫宿主植物的互作发现，豆科植物在逆境条件下的生长和存活能力具有协同优势(Bertrand et al., 2015)，这表明低温下互作的形成是双方共同作用的结果。
为了测量固氮酶活性和产量，仅在低温下比较了每种豆科植物的少数高性能菌株，因为后者的测量非常耗时。固氮酶是一种细菌酶，可催化氮 (N2) 还原为氨 (NH3)。因此，该氮酶活性标准可为低温条件下豆科饲草生长提供较高氮供应能力的菌株的筛选提供依据。具有较高固氮酶活性的豆科菌株应具有较高的季节性产量，同时使用较少的氮肥，以利于可持续农业的发展。此外，还评估了这些选定的宿主植物-菌株互作组合的产量，以验证所选菌株与未接种对照相比的生长促进潜力。
对于红豆草，北极菌株N10固氮酶活性最高，尽管该菌株每个根系的根瘤数量低于两个温带菌株116A17和USDA3172。这一结果与先前的研究一致，即与温带菌株相比，北极本土菌株N10在低温下具有更高的固氮能力(Prévost, Antoun, et al., 1987; Prévost, Bordeleau, et al., 1987)。本研究中使用的北极菌株也被证明具有更广泛的宿主特异性，因为它们是从 Maydell's oxytrope (O. maydelliana Trautv.) 中分离出来的，但与豆科相关的物种展示出一种交叉感染模式(Prévost, Bordeleau et al., 1987)。这表明，北极根瘤菌可能与环境中的北极豆科植物一起进化(Prévost，Antoun et al., 1987)。互作是细菌获取遗传信息以与外来宿主豆科植物建立有效共生的最重要方法之一(Ding et al., 2013)。这一策略对于在逆境条件下获得生态优势尤其重要，巴西塞拉多土壤中根瘤菌种之间共生基因的转移就表明了这一点，这些土壤的特点是长期高温和干旱(Barcellos et al., 2007)。加拿大高纬度北极土壤的胁迫环境，虽然与塞拉多的条件不同，但会引发类似的抵抗机制(Yang et al., 2021)，因此可以施加类似的胁迫条件，从而诱发共生伙伴的共同进化。任何菌株的植物产量均高于未接种对照的植物产量。
对于百脉根，有七种菌株可用于接种该植物。结瘤数量最多的菌株也显示出高的氮酶活性。加拿大菌株L2显示出最高的固氮酶活性，其次是EDA_LO，这是在预实验中从百脉根根系中分离出的新菌株，然后是来自法国的菌株MSDJ865(Laguerre et al., 1997)。这一结果表明，在加拿大典型的土壤低温下，加拿大本土菌株与百脉根建立共生关系的潜力很大。这一结果也支持了菌株和宿主同时进化以应对相似气候压力的概念。至于红豆草，固氮酶活性比产量更能区分与百脉根相关的菌株，因为测量到的 C2H4 产量存在巨大差异，而测试的不同菌株之间的产量相似。
不同菌株对红三叶和杂三叶的结瘤结果相似，也就是说，这两个近亲种的高结瘤菌株和低结瘤菌株是相同的。这可能是因为两个物种之间存在保守的信号通路，因此两个物种的不同品种之间的结果很可能具有一致性。报道中不同三叶草品种的豆科根瘤菌结瘤能力与我们的结果一致，并且其高度多样性可以在基因种中重新分组(Fagerli & Svenning, 2005; Kumar et al., 2015)。菌株USDA 2046的固氮酶活性低于用红三叶测试的其他菌株，而其结瘤能力和产量是最高的，这表明竞争菌株可能具有较低的共生固氮效率，反之亦然，并且这两个参数 是选择策略中必须考虑的独特性状(Irisarri et al., 2019)。对于红三叶和杂三叶，在预实验时，均观察到未接种的对照植物的根系上存在根瘤。将这些根瘤碾碎，并从单菌落中纯化出具有共生固氮能力的新菌株：两个来自红三叶的根瘤（EDA_TR1、EDA_TR2），一个来自杂三叶的根瘤（EDA_TA）。这些新的EDA菌株与收集到的菌株一样有效，并且新的 EDA_TR2 菌株尤其有效，能够与两种三叶草互作并形成大量根瘤。这些新分离的菌株可能是种子中存在的内生根瘤菌。Mora 等人报道了从未接种的菜豆（Phaseolus vulgaris）种子中分离和鉴定固氮根瘤菌菌株的情况（2014）。这表明，根瘤菌共生体可以简单地通过种子萌发来传播和繁殖，从而实现保留和分散有益根瘤菌菌株。对这些从种子中分离出来的根瘤菌菌株的基因组研究表明，这些菌株中的大多数既能结瘤又能固氮(Aguilar et al., 2018)。由此得出结论，根瘤菌在种子中的成功定植代表了寄主植物和微生物共生体之间的额外协同相互作用，从而扩大了根瘤菌可以繁殖的位点范围。我们认为，种子中内共生菌的存在也使得宿主植物种质和根瘤菌菌株的共同选择成为可能。本研究中使用的红三叶和杂三叶品种是从加拿大育种计划中培育出来的，可以同时选择可遗传的内共生体，从而产生自接种的种子。这些内共生体的存在可以解释在未接种的对照中发生结瘤，并且未接种植物的固氮酶活性与接种的红三叶和杂三叶相似。然而，需要进一步的研究来验证这一假设，因为未接种对照上的根瘤的存在也可能是由于在土壤和空气中传播的根瘤菌，正如在控制条件下与其他根际细菌所显示的那样(Bashan，1991)。

结论

本研究鉴定出了适应寒冷的根瘤菌菌株，这些菌株能够与无鼓胀豆科植物有效地结瘤并完成固氮。在气候变化的背景下，鉴定在生物和非生物胁迫下表现良好的根瘤菌菌株，对于应对豆科作物和农业面临的更高频率的胁迫事件的挑战越来越重要。从加拿大土壤中分离出来的菌株就固氮酶活性而言是最高效的，加拿大育成的红豆草和百脉根品种暗示着共生伙伴的共同进化。根据两种三叶草获得的结果，可以推测种子内共生体的存在导致了高效植物遗传物质和内共生体的共同选择。这一新途径还需要进一步探索。这项研究的结果将为适应放牧的多年生牧草提供接种剂，从而使牛肉和乳制品行业受益。通过减少对氮肥的需求，促进农业的可持续性发展。

期刊介绍

Grassland Research是我国草业科学领域第一本国际学术期刊，季刊，由中国草学会和兰州大学共同主办。该刊受中国科技期刊卓越计划高起点新刊项目支持，由国际出版集团John Wiley & Sons Australia, Ltd.提供出版及宣传服务，于2022年正式出版。
Grassland Research论文刊发范围广，综合性强。从分子到全球变化层面，全维度聚焦草业科学及其在人类可持续发展中的作用。期刊将刊登天然草原，栽培草地、草坪和生物能源作物，以及草地生态系统三大板块的基础性和应用性研究成果、综述、论点等类型的文章。优先考虑发表青年学者优秀研究成果，期待成为青年科学家喜爱的国际学术交流主阵地。
在创刊前三年，Grassland Research将免收版面费，以OA形式通过全球化出版平台Wiley Online Library出版。


原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/glr2.12054
DOI: https://doi.org/10.1002/glr2.12054
引用信息：D'Amours, E., Bertrand, A., Cloutier, J., Chalifour, F.-P., Claessens, A., Rocher, S., Bipfubusa, M., Giroux, C., & Beauchamp, C. J. (2023). Selection of rhizobial strains differing in their nodulation kinetics under low temperature in four temperate legume species. Grassland Research, 2(3), 197–211. https://doi.org/10.1002/glr2.12054

排版：王新宇
统筹：王新宇
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