文 章 信 息

期刊名称：Grassland Research（草地研究）
中文标题：探究三种草原土壤甲烷氧化菌对不同浓度甲烷消耗的水平
第一作者：王玉芳 兰州大学/中国科学院南京土壤研究所
通讯作者：Saman Bowatte 兰州大学/AgResearch；
贾仲君 中国科学院南京土壤研究所/中国科学院东北地理与农业生态研究所

编译者：苏楷淇 兰州大学草地农业科技学院 在读博士生
说明：该文仅代表编译者对论文的理解，如需参考和引用相关内容，请查阅原文。

摘 要

研究背景——土壤好氧甲烷氧化菌驱动甲烷（CH4）氧化的能力代表了草地作为CH4汇的能力。

研究方法——研究方法——本研究对比了黄土高原典型草地（Steppe）、青藏高原高寒草甸（Meadow）和中国西北内陆干旱区人工草地(Pasture)土壤对大气水平和高浓度（10%）CH4的氧化特征，并利用DNA稳定同位素示踪和Illumina Miseq测序技术研究了活性甲烷氧化菌群落结构及其对CH4氧化的作用者。

研究结果——结果表明，大气浓度CH4的氧化仅发生在草原和草甸土壤中，主要是高亲和力的USCγ是优势的甲烷氧化菌菌群。牧草土壤不能氧化大气浓度甲烷，主要是USCγ在该土壤中的相对丰度极低。然而，13CH4的DNA稳定同位素示踪实验结果表明，相比于USCγ，传统的CH4氧化菌（Methylocaldum和Methylocystis）利用大量的13CH4，用于自身生长。

研究结论——CH4氧化机制在三种不同草原土壤中表现出显著差异。USCγ群可能是专性寡营养微生物，或者它们的生长需要特定的未知条件。

关键词——草地，甲烷氧化，甲烷氧化菌，未培养的甲烷氧化菌，USCγ菌

前 言

甲烷(CH4)是通过吸收地球长波辐射诱发全球变暖的重要温室气体(Khalil & Saberi, 1987)。它对当代全球变暖的影响仅次于二氧化碳。全球大气中的CH4的平均浓度已达到1.920 μL L−1 (Lan et al., 2023)，比工业革命前的0.720 μL L−1增加了267% (dulgokencky et al.，2011)。在旱地土壤中，甲烷氧化菌(methanotrophs)对甲烷的消耗量可达30 Tg /年(Wuebbles &Hayhoe, 2002)，同时，在通气良好的形况下，草地土壤对甲烷的吸收率为4.3 Tg/年，因此其被看作为主要的CH4汇之一(Dutaur & Verchot, 2007)。在中国，草地是仅次于森林的第二大CH4汇，每年可消耗0.65 Tg CH4(Y. Wang et al., 2014)。因此，草地吸收CH4的能力对平衡大气中的甲烷浓度具有重要意义。

1982年，人们发现甲烷氧化菌可以氧化CH4 (Harriss et al., 1982)，但直到2003年，它们才被命名为USC，其中包括USCα和USCγ亚群(Knief et al., 2003)。随后的研究发现，这些新型的甲烷氧化菌存在于不同类型的通气良好的土壤中(Deng et al., 2019; Henckel et al., 2000;Kou t al., 2020)。Tveit等人(2019)报道了一种甲烷化菌的分离和表征，该菌可以在大气中生长，并利用大气CH4作为碳和能量来源。由于该甲烷化菌与USCα亲缘关系较近，因此将其命名为Methylocapsa gorgona MG08。Tveit等人(2019)提出M. goorgona MG08具有典型的兼性生理代谢特性，不仅能够氧化大气中的CH4，还能够氧化高浓度的CH4。其他研究表明，水稻土中某些特定的常规甲烷氧化菌具有通过初始氧化升高的CH4来氧化低浓度CH4的潜力(Cai et al.，2016)。然而，在草地土壤中还没有类似的研究报告。

草原生态系统是除森林之外最重要的甲烷汇。以往对草地土壤CH4氧化通量的研究多集中在土壤环境或农艺因素上，如湿度(Dijkstra et al., 2011; Liu et al., 2021; Qi et al., 2022)、温度(Gu et al., 2019; Odriozola et al., 2014; van den Pol‐van Dasselaar et al., 1998)、氮肥施用(Blankinship et al., 2010;Dai et al., 2013; Nanba & King, 2000)和放牧强度(Abell et al., 2009; van den Pol‐van Dasselaar et al., 1999; X. Zhou et al., 2010)上。虽然甲烷氧化菌在氧化过程中起主要作用，但对其的研究仅限于内蒙古典型草原(Kou et al., 2020; Ma et al., 2016),、青藏高原高寒草甸(Deng et al.， 2019;Kou et al., 2020)和黄土高原典型草原(Y. Wang et al., 2022)土壤中出现的USCγ菌和常规I型、II型甲烷氧化菌，而对于草地土壤中的微生物报道非常有限。因此，本研究旨在探讨草地土壤中CH4氧化的机理。

本研究通过室内培养实验，研究了三种草地土壤中的甲烷氧化菌对大气CH4和高浓度(10%)CH4的响应。同时，利用土壤DNA稳定同位素探测(SIP)微环境和高通量测序技术，对大气CH4浓度下的甲烷氧化菌群落进行了研究。

材料与方法

研究区概况

样本区均位于甘肃省，包括2个天然草地(高寒草甸alpine meadow和典型草原typical steppe)和1个人工草地(典型牧场typical pasture)。天然草地分别位于庆阳市环县和甘南藏族自治州玛曲县。环县属黄土高原丘陵沟壑区，属温带大陆性季风气候。全境90%以上被黄土覆盖，土层厚度在60 ~ 240 m之间。玛曲县位于青藏高原的最东端，于甘肃、青海和四川的交界处，属大陆性高寒湿润地区，气温低，风大，雨大，雪大，没有四季(只有冷暖季节)。人工草地位于张掖市临泽县，属大陆性荒漠草原气候，气候干燥，雨量少，蒸发量大，多风。环县、玛曲、临泽三处草地土壤分别称为草原土壤、草甸土壤、牧场土壤。

土壤样品

在每个草地上，从3个面积为50 m × 50 m的区域采集土壤样本，每个区域使用直径为10 cm的土壤覆盖物取10个深度为10 cm的土壤岩心并进行堆积。除去土植物残体、石块和其他惰性物质，土壤样品通过2mm筛。

表1：三种不同草地土壤的理化性质。

基因组 DNA 提取、DNA-SIP 和定量聚合酶链反应 (qPCR)
所有土壤样品的总基因组DNA(D0和 D50)根据制造商的说明，使用FastDNA® SPIN试剂盒(MP生物医学)。将提取的DNA溶解在100μL去离子无菌水中，并使用紫外分光光度计(纳米滴技术)测定其浓度和质量。DNA的浓度范围为30至120 ng μL−1， A260/A280范围为 1.70 -1.90。从孵育50天的土壤中提取的DNA进行超高速密度梯度离心。使用700 μL聚乙二醇6000沉淀将核酸从CsCl溶液中分离出来，用70%乙醇洗涤纯化，然后溶解在30 μL TE缓冲液中，储存在-20°C以备后续13通过pmoA基因的qPCR鉴定13C-DNA。使用引物A189F和mb661r(Costello&Lidstrom，1999)进行针对pmoA基因的qPCR测定。实时荧光定量qPCR标准品使用102–108基因拷贝 μL−1含有pmoA基因片段的质粒稀释系列。使用含有克隆靶基因的pEASYT1克隆试剂盒和含有克隆靶基因的TaKaRa MiniBEST质粒纯化试剂盒Ver. 4.0制备用于校准的质粒DNA。引物对的扩增效率在83.6%至98.2%之间，R2值为 0.990–0.999。

16S 核糖体 RNA 和 pmoA 基因的高通量测序
16S核糖体RNA(rRNA)和pmoA基因分别使用通用细菌引物对515F / 907R(Stubner，2002)和A189f / mb661r(Costello&Lidstrom，1999)通过Illumina MiSeq测序从DNA提取物中扩增。在Goldview染色的1.2 g 100 mL−1琼脂糖凝胶上验证16S rRNA和pmoA基因扩增子的大小和特异性(单带)，使用Mini BEST DNA片段纯化试剂盒，3.0版(TaKaRa Biotech)纯化，使用紫外分光光度计(NanoDrop Technologies)定量，并以等摩尔比混合。扩增子文库使用TruSeq Nano DNA LT样品制备试剂盒A(24个样品)构建，然后使用Illumina MiSeq系统(Illumina)与试剂盒v2 2 × 250 bp对16S rRNA基因和试剂盒v2 2 × 300 bp对pmoA基因进行测序。使用mothur软件(版本16.1.41)处理2009S rRNA和pmoA基因的原始FASTQ数据，使用MEGA7.0软件(分子进化遗传学分析，版本7.0)构建系统发育树(Kumar等人，2016)。

统计分析
土壤理化性质用各草地三次重复值的平均值±标准误差表示。使用Excel 365整理数据，Origin 2021绘图，IBM SPSS Statistics 20.0对pmoA基因的丰度以及16S rRNA甲烷化菌样序列与pmoA基因的相对丰度进行单向方差分析，使用Duncan's检验进行均值分离。p < 0.05表示显著性。

结 果

大气压和高浓度CH4氧化电位和甲烷氧化菌丰度

草原、草甸和牧场土壤中大气CH4的氧化电位存在显著差异，草原和草甸土壤中存在氧化电位，牧场土壤中不存在氧化电位。且3种土壤均能氧化高浓度CH4。

图1 不同草地土壤对大气和浓度升高的CH4(10%)的反应结果。D0和D50土壤孵化下的CH4浓度随大气CH4浓度的变化(a)，D0和D50土壤孵化下的CH4浓度随升高CH4浓度的变化(b)，pmoA基因测定D0和D50时土壤中甲烷氧化菌丰度(c)。
注：不同小写字母和大写字母表示D0和D50表示显著差异(p < 0.05)。CH4，甲烷。

三种土壤在D0的13C丰度为1.08%±0.006%。13CH4氧化导致草原、草甸和牧场土壤中有机碳13C丰度值分别增加至1.7%±0.2%、1.3%±0.2%1.4%±0.01% (图2)。三种草地土壤有机13C含量的净增加量也发生了变化(图2b)。同时， qPCR分析表明，pmoA基因的丰度在D50出现了显著增加。

图2 D0和D50下的土壤总有机碳中13C原子丰度的百分比(a)和土壤总有机碳中13C的净增加量(b)

甲烷氧化菌成分随CH4浓度的升高而变化

系统发育树表明(图3)，土壤中主要含有与I型(Methylocaldum、Methylosarcina和Methylobacter)和II型(Methylocystis和Methylosinus)以及与USCα和USCγ密切相关的甲烷氧化菌。

图3 基于pmoA部分基因序列的吸收13CH4的甲烷氧化菌的系统发育树(a)和16S rRNA基因序列(b)。
注：使用MEGA软件(版本7.0.26)构建邻居连接树，并进行1000次重复引导。只有在分支节点上给出高于50%的引导值。刻度条表示每个核苷酸或pmoA和16S rRNA基因的氨基酸位置。rRNA，核糖体RNA

16S rRNA基因的测序和pmoA基因序列结果显示草原土壤(D0)中USCγ(USCγ + JR3)的相对丰度为95.9%±0.4%。I型Methylocaldum的丰度为2.2%±0.2%。50 d后，Methylocalduum的相对丰度显著增加(p < 0.01)至92.4% ±1.9%。相比之下，D50的USCγ的相对丰度下降(p < 0.01)至1.4%，±0.5%。其他嗜甲烷菌的相对丰度则没有显著性差异。在草甸土壤中，USCγ从44.7%±6.1%(D0)下降至0.5% ± 0.01% (D50)，而Methylocystis从30.6%±3.1%(D0)显著增加为97.4% ± 0.2% (D50)。在牧场土壤中，USCγ 和Methylocystis从4.7%±1.2%和24.9%±0.9% (D0)下降至 0.4% ± 0.06%和8.4% ±4.0% (D50)，而Methylobacter和Methylosarcina分别D0下的0.8%±0.1%和1.7%±0.2%急剧增加至 5.9% ± 0.2%和16.8% ±5.9% (D50)。Methylocaldum(I型)也增加了(D50)，但不显著(p < 0.01)。

图4 三个草原甲烷氧化菌群落特征。13CH4孵育前后土壤甲烷化养菌群落组成的pmoA扩增子测序(a)；16S rRNA (b)基因; pmoA扩增子测序结果显示，D50上主要甲烷氧化菌相对于D0的相对丰度和倍数增加(c)；16S rRNA (d)基因分别在草原、草甸和牧场中的表达。

活性甲烷氧化菌组分在高浓度CH4下的检测

qPCR数据显示，13C - DNA标记下的pmoA基因的最大数值出现在浮力密度梯度为1.730-1.745 g mL−1时，草原、草甸和牧场土壤中的pmoA基因丰度分别为7.67 × 107、6.23 × 108和4.19 × 108 g−1；而12C - DNA标记的pmoA基因的最大数值出现在浮力密度梯度的1.715-1.725 g mL−1，三种土壤对应的pmoA基因丰度分别为5.01 × 109、2.84 × 107和8.23 × 108 g−1。对嗜甲烷菌进行高通量测序(16S rRNA和pmoA基因)后得知13CH4主要被常规I型和II型嗜甲烷菌同化。其中，草原土壤中的 I型Methylocaldum和II型Methylocystis，分别占了16S rRNA基因总数的9.7%和0.16%(图5f)。其余的I型和II型嗜甲烷菌分别仅占0.6%和4.8%(图5f和表2)。草甸土壤的主要的嗜甲烷菌是Methylocystis，占16S rRNA基因总数的44.1%(图5g)，其他嗜甲烷菌仅占1.3%。牧场土壤中的Methylocaldum, Methylosarcina和 Methylobacter菌种分别为21.5%, 9.2%和8.6%，其中I型为主要菌种，II型仅占2.1%。值得注意的是，在3个样地中，USCγ在草原和草甸土壤中占主导地位(D0)，然而， USC 16S rRNA序列的比例非常低(表2)(图5d,e)。

图5 DNA稳定同位素探测(SIP)和高通量测序分析下检测的活性甲烷化菌。pmoA基因在草原(a)、草甸(b)和牧场(c)的DNA - SIP梯度组分qPCR定量分布结果(a-c)。通过16S rRNA基因估计的每个DNA - SIP梯度片段中USCα (d)和USCγ (e)的相对丰度(d-e)。根据草原(f)、草甸(g)和牧场(h)中总16S rRNA基因的扩增子测序，各DNA片段中13C‐甲烷化养菌的相对丰度(f-h)。(i) 13CH4培养土壤中甲烷氧化菌的相对丰度(通过重DNA - SIP梯度组分中pmoA基因的扩增子测序估计)。
注：qPCR, 定量聚合酶链反应

表2 不同嗜甲烷菌基团的相对丰度(通过16S rRNA基因测序估计)13C标记的DNA部分。

讨 论

本研究结果与前人关于草地土壤CH4吸收能力的研究结果一致，即三种草地土壤的CH4氧化机制呈现差异结果。草原和草甸土壤能够氧化大气中的CH4，而牧场土壤则不能。在草原和草甸土壤中，USCγ菌群分别占甲烷氧化菌的92.6%和45%；而在牧场土壤中，只有5.9%的甲烷氧化菌由USCγ组成(图4a)。因此，这解释了在试验中不同土壤对甲烷消耗的差异。

在高浓度13CH4条件下，三种土壤的pmoA基因数值均显著增加(图1c)，这证实了土壤中甲烷化菌的数量的变化。这些值在先前报道的草地土壤甲烷氧化菌丰度范围内(Abell et al., 2009; Ma et al., 2016; Zheng et al., 2012)。研究发现，在甲烷化菌数量和13CH4浓度增加的情况下，草原、草甸和牧场土壤中有机碳中13C的丰度相对于出现1.08%的增加(图2a)，很可能在孵育期间，高浓度的13CH4甲烷氧化导致大量13C标记的代谢物产生(甲醇、甲醛和甲酸)(Krause et al.， 2017)，这表明了非甲烷氧化菌的交叉饲养特性。从重DNA - SIP梯度馏分中检测到的非甲烷氧化菌可以看出这一点(表4)。增加的嗜甲烷菌种群主要表现为传统的I型和II型嗜甲烷菌。研究发现，草原、草地和牧场土壤中的USCγ不吸收来自高浓度标记CH4(13CH4)的碳原子。但是，也有研究报道，新分离的与USCα相关的甲烷氧化菌能够从升高的CH4中吸收碳(Chiri et al., 2020; Tveit et al., 2019)。这可能是由于传统的甲烷氧化菌在利用高浓度的CH4和消耗13CH4方面具有绝对优势。

与常规甲烷氧化菌相比，USCγ可能缓慢地吸收13CH4，但我们在16S rRNA和pmoA基因测序中未检测到USCγ。然而，我们也要考虑到16S rRNA和pmoA基因测序在准确定量方面的缺陷(Alteio et al.， 2021)。

表3 不同产甲烷菌基团的相对丰度(由pmoA基因估计)13C标记的DNA部分。

结果显示，草原、草甸和牧草土壤中嗜甲烷菌的组成存在显著差异(图4a，D0)，这可能受到土壤异质性、地理条件和气候的影响(Knief，2015 年;纳扎里et al.,，2018 年)。草原嗜甲烷菌群落以USCγ(JR3)为主，占90%以上，这与此前报道的内蒙古草原中含有大量的USCγ嗜甲烷菌群落的结论一致(Ma et al., 2016; X. Q. Zhou et al., 2008)。土壤pH值是影响嗜甲烷菌群落的关键因素，在pH值大于6的土壤中，USCγ菌群出现的可能性较大。因此，与草甸和牧场土壤相比，高土壤pH值(表1)对USCγ来说有优势(Deng et al., 2019)。草甸土壤中的甲烷营养菌群落组分不同，由USCs，I型，II型和未分类(其他)组成。高寒土壤中嗜甲烷菌的多样性也可能受到高寒草地丰富的植物多样性的影响。植被类型将直接或间接影响甲烷营养菌对CH4的吸收由(Y. Yang et al., 2013; M. Yang et al., 2016)。研究发现，牧场中的甲烷吸收菌含量最多(23%)，与天然草原相比，人类活动(如灌溉、施肥、整地和植被变化)对土壤环境的干扰范围可能导致牧场甲烷营养群落发生显著变化(Anna et al.，2018)。与II型嗜甲烷菌相比，I型嗜甲烷菌的耐盐性更强(Hao et al., 2019)，这可能是I型和II型嗜甲烷菌比例在牧场中的不同的原因。

表4 重DNA-SIP梯度部分中嗜甲烷菌和非嗜甲烷菌的相对丰度

DNA - SIP结果表明，在高CH4条件下，草地土壤中的一些常规甲烷氧化菌变得活跃起来(图5i)。这一发现很重要，例如在强降雨事件之后，草地中偶尔会出现CH4升高的区域(Hu et al.， 2005)。在这种情况下，低亲和力的甲烷营养菌可能会变得活跃并可能消耗大量的CH4，从而减少草原甲烷排放。然而，强降雨等事件也可以通过限制 O2 来抑制嗜甲烷菌活性。在我们的研究中，当土壤暴露于高浓度的CH4下，土壤中活性嗜甲烷菌存在显著差异。然而，关于草原土壤中活性微生物研究的文献有限(Li et al., 2022 年; Wang et al., 2014)。因此，不同草地活性微生物差异的具体原因有待进一步研究。

结 论

3种草地土壤CH4氧化机制差异显著。大气CH4的氧化在草原和草甸土壤中均有发生，而在牧场土壤中没有发生。土壤中USCγ甲烷氧化菌的比例可能解释了土壤中大气CH4消耗的差异。DNA - SIP结果表明，在高CH4条件下，草地土壤中一些常规甲烷氧化菌变得活跃。II型Methylocystis是草甸草地土壤中主要的活性甲烷化菌;在牧场土壤中，I型Methylocaldum为主要的活性甲烷化菌；在草原土壤中，活跃的甲烷氧化菌由Methylocaldum和Methylocystis组成。然而，在高浓度CH4条件下，USCγ甲烷氧化菌无法吸收CH4，这表明USCγ群可能是专性寡营养微生物，或者它们的生长需要特定的未知条件。

原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/glr2.12048
引用格式：Wang, Y., Cai, Y., Hou, F., Bowatte, S., & Jia, Z. (2023). Elevated and atmospheric‐level methane consumption by soil methanotrophs of three grasslands in China. Grassland Research, 2(2), 85–96.
排版：王楚怡
统筹：王新宇
声明：该编译文章仅代表编译者对原文的理解，如需参考和引用相关内容，请查阅原文。编译文章由GR团队制作仅供学术交流，转载须注明转载自Grassland Research微信公众号及编译作者信息。End

期刊介绍

Grassland Research是我国草业科学领域第一本国际学术期刊，季刊，由中国草学会和兰州大学共同主办。该刊受中国科技期刊卓越计划高起点新刊项目支持，由国际出版集团John Wiley & Sons Australia, Ltd.提供出版及宣传服务，于2022年正式出版。

Grassland Research论文刊发范围广，综合性强。从分子到全球变化层面，全维度聚焦草业科学及其在人类可持续发展中的作用。期刊将刊登天然草原，栽培草地、草坪和生物能源作物，以及草地生态系统三大板块的基础性和应用性研究成果、综述、论点等类型的文章。优先考虑发表青年学者优秀研究成果，期待成为青年科学家喜爱的国际学术交流主阵地。

在创刊前三年，Grassland Research将免收版面费，以OA形式通过全球化出版平台Wiley Online Library出版。