在蛋白质组学研究中，样品制备是决定成败的第一步。没有一种方法能提取所有蛋白质——不同样本类型、不同研究目的，都需要匹配不同的提取策略。

本期三篇文章，分别聚焦肌肉组织、酵母细胞、小胶质细胞三种典型样本，为您提供方法学参考。

1

肌肉组织：SDS法 vs 尿素法

Protein Extraction Methods Suitable for Muscle Tissue Proteomic Analysis

适用于肌肉组织蛋白质组学分析的蛋白质提取方法

https://doi.org/10.3390/proteomes12040027

肌肉是哺乳动物身体中最具动态性和可塑性的组织之一，承担着力学产生和代谢调控等多种功能。肌肉蛋白质组学为揭示肌肉病理生理背后的分子机制提供了重要机会。

意大利研究团队系统比较了两种提取方法对小鼠肌肉蛋白的效果：

方法A：基于SDS的提取缓冲液

方法B：UREA/CHAPS/DTE/TRIS溶液 (尿素法)

通过二维凝胶电泳结合图像分析，研究发现：

两种方法都能获得良好的凝胶分辨率和斑点重叠

方法B检测到的总斑点数量更多

两种方法提取的蛋白质在理化性质和细胞定位上存在显著差异

方法A提取的蛋白更多集中在收缩相关蛋白 (肌球蛋白、肌动蛋白等肌原纤维蛋白)

方法B提取的蛋白更多涉及代谢酶、信号转导分子等胞浆蛋白

启示

如果研究肌肉收缩功能，可选SDS法 (更多提取肌原纤维蛋白)；如果研究代谢调控，可选尿素法 (更多提取胞浆蛋白)；如需全面覆盖，可考虑两种方法并行。

2

酵母细胞：基因敲除株的提取策略

Evaluating Protein Extraction Techniques for Elucidating Proteomic Changes in Yeast Deletion Strains

揭示酵母缺失突变株蛋白质组学变化的蛋白质提取技术评价

https://doi.org/10.3390/proteomes13030028

蛋白质提取和分析的工作流程比较

酵母是研究真核生物细胞功能和调控网络的重要模式生物，其许多通路在高等真核生物中高度保守。研究酵母敲除株的蛋白丰度变化，常被用于揭示基因功能和调控网络。

哈佛医学院研究团队评估了不同蛋白提取技术在酵母基因敲除株中的效果。研究使用siz1Δ和nfi1Δ两种酵母敲除株，比较了：

去垢剂裂解法 (Detergent-based Lysis)：使用RIPA缓冲液等去垢剂进行细胞裂解

机械裂解法 (Mechanical Lysis)：使用Silica Beads进行机械破碎

结合TMTpro标记和质谱分析，共鉴定到超过4700种蛋白，覆盖约80%的酵母蛋白质组。结果发现：

1. 方法选择对数据的影响

去垢剂裂解法提取蛋白的效果优于机械裂解法。更重要的是，方法选择对蛋白质组数据的影响，甚至超过了基因型差异本身。主成分分析显示，不同提取方法造成的样本聚类差异远大于不同基因型之间的差异。

2. 基因型差异的检测

尽管siz1Δ和nfi1Δ两种敲除株的整体蛋白组变化很小，但仍有少数蛋白在两种裂解方法下都显示出一致的变化。例如，Ino1和Rep1等蛋白在两种敲除株中表达水平均有改变，提示这些蛋白可能受到SUMO化修饰的调控。

启示

在研究基因敲除株时，需要谨慎选择提取方法，避免方法偏差掩盖真实的生物学差异。同时，跨方法验证可以增加发现可靠差异蛋白的信心。

3

小胶质细胞：微量样本的深度覆盖

Deep Proteome Coverage of Microglia Using a Streamlined Data-Independent Acquisition-Based Proteomic Workflow: Method Consideration for a Phenotypically Diverse Cell Type

利用简化数据独立采集蛋白质组学工作流程实现小胶质细胞的深度蛋白质组覆盖：针对具有不同表型的细胞类型的方法考量

https://doi.org/10.3390/proteomes12040035

小胶质细胞是大脑的主要先天性免疫细胞，在各种稳态和疾病相关过程中发挥关键作用。为执行其众多功能，小胶质细胞呈现出广泛的表型状态。蛋白质组能更准确地反映这些表型的分子特征，但小胶质细胞的分析面临独特挑战：表型多样性导致蛋白表达谱复杂，且来自体内实验的小胶质细胞数量有限，蛋白量可能不足。

南佛罗里达大学研究团队开发了一种简化、可重复的方法，用少量样本实现小胶质细胞的深度蛋白质组覆盖。

研究方法

细胞模型：成年小鼠来源的永生化小胶质细胞 (IMG细胞)

 样本制备：使用iST试剂盒处理细胞，蛋白量标准化为10 µg

肽段分级：部分样本进行溶液相分级 (3个组分)，部分样本不分级

质谱分析：采用TIMS-TOF质谱仪，结合离子淌度 (IM) 气相分级和PASEF采集模式

谱图库构建：(1) 经验性谱图库：通过深度分级和DDA  (data-dependent acquisition) 分析构建；(2) 预测谱图库：基于Uniprot小鼠数据库，通过DIA-NN深度学习预测生成

当前研究面临高质量酶特异性数据缺乏、PTM定位误差等挑战。未来需将精密计算策略与实验技术深度整合，借助人工智能和高通量分析，进一步解析复杂的PTM酶-底物网络。

关键发现

1. 经验性谱图库的覆盖深度

通过120分钟梯度、两个IM分级的DDA-PASEF分析，从10 µg起始样本中成功构建了包含9140种蛋白的经验性谱图库。这是目前小胶质细胞蛋白质组学研究中覆盖深度较高的数据集之一。

2. 单次DIA分析的鉴定能力

使用经验性谱图库，从单次DIA分析 (200 ng进样量) 中平均可鉴定7264种蛋白/run。使用预测谱图库，平均可鉴定7519种蛋白/run。两种谱图库具有互补性，结合使用可将覆盖度提升至约8000种蛋白。

3. 谱图库互补性的重要性

研究发现，一些与小胶质细胞功能相关的重要通路 (如特定的免疫应答通路) 只能通过经验性谱图库鉴定到。这说明针对特定细胞类型优化谱图库的重要性——仅依赖通用预测库可能会错过关键的功能蛋白。

4. 方法可推广性

该工作流程使用的起始样本量少 (10 µg蛋白)，操作相对简化，对于研究稀缺细胞类型 (如FACS分选的原代小胶质细胞、特定脑区来源的微量样本) 具有重要参考价值。

启示

对于表型多样的细胞类型，经验性谱图库与预测谱图库结合使用可以获得最全面的蛋白质组覆盖。研究者应根据样本可得性和研究目的选择合适的谱图库策略。

• Proteomes 期刊介绍

主编：Jens R. Coorssen, Institute for Globally Distributed Open Research and Education (IGDORE), Canada; Matthew P. Padula, The University of Technology Sydney, Australia

期刊专注于蛋白质组分析的各个方面，特别关注蛋白质组在蛋白质形式 (proteoforms)、功能性生物学单元以及标准氨基酸序列水平上的定量和表征。目前已被Scopus、ESCI (Web of Science)、PubMed等数据库收录。

2024 Impact Factor：3.6

2024 CiteScore：7.2

Time to First Decision：28.6 Days

Acceptance to Publication：5.6 Days

期刊主页：https://www.mdpi.com/journal/proteomes