研究结果：

1. 司美格鲁肽在不减轻体重的情况下改善小鼠肝脏病理

研究人员使用了Glp1r^Wnt1+/+和Glp1r^Wnt1-/-雄性小鼠，在这些小鼠中，Glp1r在表达Wnt1的神经元中被删除，但在不表达Wnt1的肝脏中则保留完整（图S1A和S1B）(小编注：Tek是肝脏血管内皮细胞（LSEC）最特异的标志物，在肝脏样本的检测中，Tek信号的强阳性证明实验人员确实取到完整的肝脏组。Wnt1神经靶向驱动子，在同样的肝脏样本中，Wnt1信号的阴性证明这些肝脏细胞（Tek⁺），确实不表达Wnt1基因。S1B比较Wnt1和Tek，用Tek作为肝脏取材成功的标志物， Wnt1的阴性结果做对照，严格证实了Glp1r在肝脏中未被Cre重组酶编辑，基因序列保留完整)。给小鼠喂食高果糖高胆固醇饮食（HFHCD）16周，然后转换为胆碱缺乏的高脂饮食（CDHFD）继续喂养12周（图1A）。根据血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平确认肝损伤后将小鼠随机分组，每天皮下注射生理盐水或司美格鲁肽持续8周（图1A），各组在治疗开始时体重相当。司美格鲁肽降低了Glp1r^Wnt1+/+小鼠的体重，但在Glp1r^Wnt1-/-小鼠中未见此效应，后者维持了与生理盐水组相似的体重变化趋势（图1B–1D）。Glp1r^Wnt1+/+小鼠的体重下降伴随着脂肪量、去脂体重、肝脏重量、腹股沟白色脂肪组织（iWAT）、性腺白色脂肪组织（gWAT）和棕色脂肪组织（BAT）的减少（图1E、S1C和S1D）。在接受司美格鲁肽治疗的Glp1r^Wnt1+/+小鼠中肝脏重量降低，而在Glp1r^Wnt1-/-小鼠中降低程度较小（图S1C和S1D）。胰腺重量作为GLP-1受体激动剂反应性的生物标志物，在两种基因型小鼠中均被司美格鲁肽增加（图S1C和S1D）。

司美格鲁肽在Glp1r^Wnt1+/+和Glp1r^Wnt1-/-两种基因型小鼠中均改善了葡萄糖代谢，表现为空腹血糖水平降低，以及在口服葡萄糖耐量试验（OGTT）期间葡萄糖偏移得到改善（图1F和1G）。司美格鲁肽还降低了Glp1r^Wnt1+/+小鼠的血清总胆固醇和LDL水平，但未降低Glp1r^Wnt1-/-小鼠的这两项指标（图S1E）。各组之间的血清甘油三酯水平没有差异（图S1E）。在两种基因型小鼠中，司美格鲁肽均降低了肝损伤标志物（包括血清ALT和AST）（图1H）。ALP水平也下降，而总胆红素保持不变（图S1F）。组织学分析显示，接受司美格鲁肽治疗的Glp1r^Wnt1+/+和Glp1r^Wnt1-/-小鼠肝脏脂肪变性和纤维化减少，同时肝脏中纤维化相关基因（如Col1a1）的mRNA表达降低，而Col4a1、Tgfb1和Acta2的水平呈降低趋势，但在司美格鲁肽治疗的小鼠中并非一致地降低（图1I和1J）。

为了评估这些发现的普适性，雌性Glp1r^Wnt1+/+和Glp1r^Wnt1-/-小鼠被喂食HFHCD 24周，并注射AAV8.ApoEHCR-hAAT.D377Y-mPCSK9.bGH（AAV8-PCSK9）以升高血清胆固醇。（小编注：本研究采用尾静脉注射AAV8-PCSK9联合高脂高胆固醇饲料（HFHCD）构建混合型高胆固醇MASH模型。该突变型PCSK9可加速肝细胞LDL受体内吞降解，阻断血浆LDL清除，快速诱导高胆固醇血症，模拟人类高胆固醇合并非酒精性肝炎的病理特征。该模型无需基因改造，可在多种遗传背景小鼠中高效造模，避免了传统基因敲除模型的遗传背景干扰）病毒注射后1周，小鼠每天接受司美格鲁肽或生理盐水直至研究终点（图1K）。接受司美格鲁肽治疗的Glp1r^Wnt1+/+雌性小鼠表现出显著的体重减轻（图1L–1N），伴有脂肪量减少（图1O）以及iWAT和gWAT的总重量和相对重量减少（图S1G和S1H），而瘦体重和总水分没有变化（图1O），这些效应在Glp1r^Wnt1-/-小鼠中不存在。有趣的是，接受司美格鲁肽治疗的Glp1r^Wnt1-/-雌性小鼠的肝脏重量也减少了（图S1G和S1H）。在BAT重量、血清总胆固醇或HDL及LDL水平方面未观察到差异（图S1G–S1I）。血清甘油三酯水平在Glp1r^Wnt1+/+小鼠中被司美格鲁肽降低，而在Glp1r^Wnt1-/-小鼠中基线时已经较低，治疗后未进一步降低（图S1I）。司美格鲁肽改善了两种基因型小鼠的葡萄糖代谢（图1P和1Q）。重要的是，司美格鲁肽治疗降低了Glp1r^Wnt1+/+和Glp1r^Wnt1-/-雌性小鼠的血清ALT和AST水平（图1R）。未检测到ALP或总胆红素水平的变化（图S1J）。（小编注：ALT/AST主要储存于肝细胞胞质与线粒体，升高提示肝细胞坏死/脂肪性炎症；ALP、胆红素主要来源于胆管上皮损伤及胆汁淤积。本HFHCD+AAV8-PCSK9模型仅诱导肝细胞脂肪性炎症，无胆管损伤及胆汁淤积，因此这两项指标基线无异常，药物干预后也无显著变化）在组织学上，司美格鲁肽在Glp1r^Wnt1+/+和Glp1r^Wnt1-/-雌性小鼠中均减少了天狼星红和油红O染色（图1S），同时肝脏中纤维化相关基因Col1a1和Col4a1的表达降低，而Tgfb或Acta2水平没有变化（图1T）。因此，司美格鲁肽在不同性别和不同饮食诱导的MASH模型中改善肝脏病理，并不依赖于体重减轻。

图1. 司美格鲁肽在不减轻体重的情况下改善肝脏健康

辅图1 司美格鲁肽对组织生物测量学和血清生化指标的影响

2.司美格鲁肽对肝脏脂肪变性、纤维化和免疫重塑的部分效应独立于体重减轻

为了识别司美格鲁肽不依赖体重减轻的肝脏获益，研究人员研究了喂食标准饮食（STD）或CDHFD以诱导MASH的Glp1r^fl/fl和Glp1r^Wnt1-/-雌性小鼠。喂食CDHFD的小鼠被随机分配接受每日皮下注射生理盐水或司美格鲁肽，持续约2个月（图2A和图S2A）。在两种基因型中，CDHFD喂养导致体重增加（图2B–2D和图S2B–S2D），脂肪量增加而瘦体重或总水分无变化（图2E和图S2E），葡萄糖代谢受损（图2F、2G、S2F和图S2G），以及显著的肝损伤（图2H、2I、S2H和图S2I）。司美格鲁肽在喂食CDHFD的Glp1r^fl/fl小鼠中导致体重减轻（图S2B–S2D），但在Glp1r^Wnt1-/-小鼠中没有（图2B–2D）。在接受司美格鲁肽治疗的Glp1r^fl/fl小鼠中，脂肪量呈降低趋势（图S2E），而在接受司美格鲁肽治疗的Glp1r^Wnt1-/-小鼠中，体重和脂肪量均未减少（图2B–2E）。司美格鲁肽改善了两种基因型小鼠的葡萄糖代谢（图2F、2G、S2F和图S2G），并降低了Glp1r^fl/fl小鼠的ALT和AST水平，但未降低Glp1r^Wnt1-/-小鼠的这两项指标（图2H和图S2H）。组织学分析显示，喂食CDHFD的动物出现明显的肝脏脂肪变性和纤维化。引人注目的是，无论体重是否变化，司美格鲁肽治疗均逆转了这些特征，将肝脏组织学特征恢复至几乎与STD喂养对照组相当的水平（图2I和图S2I）。

除了减轻脂肪变性和纤维化之外，GLP-1类药物还能降低肝脏炎症，而肝脏炎症是MASH的一个关键特征。因此，研究人员对来自不同饮食和治疗组的Glp1r^fl/fl和Glp1r^Wnt1-/-小鼠的肝脏单细胞悬液进行了全面的免疫表型分析。流式细胞术分析显示，由CDHFD喂养诱导的肝损伤与总T细胞的显著扩增和B细胞的明显耗竭相关，而其他肝脏免疫细胞亚群的比例基本保持不变（图2J–2N和图S2J–S2N）。（小编注：CDHFD诱导MASH引发肝脏损伤时，会特异性打破肝脏淋巴细胞的稳态，造成肝脏总 T 细胞显著扩增、B 细胞明显耗减，而其他肝脏免疫细胞亚群的占比并未出现明显改变，这也证实 T 细胞与 B 细胞是该 MASH 模型中参与肝脏炎症反应的关键免疫细胞类群；结合上文已知 GLP-1 受体并不表达于肝细胞、库普弗细胞、肝星状细胞等介导 MASH 病理进程的核心肝脏细胞，仅存在于肝脏 T 细胞、内皮细胞等非实质细胞，同时 GLP-1 类药物可有效改善肝脏脂肪变性、纤维化与炎症的研究结论，以及该细胞亚群的特异性变化进一步提示，GLP-1 药物发挥不依赖减重的肝脏保护与抗炎作用，大概率并非通过广泛调控肝脏各类免疫细胞实现，而是主要靶向发生明显数量改变的 T 细胞与 B 细胞，尤其是表达 GLP-1 受体的肝脏 T 细胞，以此调节局部免疫失衡、抑制炎症进展）虽然司美格鲁肽并未使总T细胞数量恢复正常，但它恢复了Glp1r^fl/fl小鼠肝脏中B细胞的比例（图S2J和S2K）。这种效应在Glp1r^Wnt1-/-小鼠中也得到部分保留（图2J和2K），表明B细胞的恢复至少部分是通过不依赖体重减轻的机制发生的。

对T细胞亚群的分析显示，CDHFD喂养增加了肝脏CD8a⁺ T细胞的总体比例，并选择性地扩增了CD8a⁺和CD4⁺效应记忆T细胞，而未改变CD4⁺ T细胞的总比例。（小编注：效应记忆T细胞（Tem）定植于肝组织，受脂质代谢紊乱刺激后大量增殖，持续分泌IFN-γ、TNF-α等促炎因子，直接驱动肝脏慢性低度炎症；总CD4⁺T细胞数量不变提示亚群内部发生表型重编程而非细胞整体增殖）司美格鲁肽治疗在Glp1r^fl/fl和Glp1r^Wnt1-/-小鼠中均减弱了这种效应记忆偏移（图2L–2N和图S2L–S2N）。相比之下，在Glp1r^Wnt1-/-小鼠中，CDHFD显著减少了CD8a⁺和CD4⁺中央记忆T细胞，而司美格鲁肽部分恢复了它们的丰度，尤其是在CD4⁺细胞区室中（图2L–2N）。相反，司美格鲁肽未能降低Glp1r^Wnt1-/-小鼠中升高的肝脏巨噬细胞比例（图2K），表明巨噬细胞的调节可能更强烈地依赖于体重减轻。

研究人员接下来评估了全肝组织中的细胞因子水平，以进一步表征与司美格鲁肽治疗相关的炎症环境。大多数细胞因子，包括干扰素（IFN）γ、白介素（IL）-10、IL-12、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5和IL-6，在各组中要么检测不到，要么处于非常低的水平。相比之下，在两种基因型的司美格鲁肽治疗小鼠中，中性粒细胞趋化因子KC（CXCL1）的水平显著升高（图2O和图S2O），而肿瘤坏死因子α（TNF-α）——一种关键的促炎细胞因子——在喂食CDHFD的Glp1r^fl/fl小鼠中显著升高，并因司美格鲁肽治疗而降低（图S2P）。在Glp1r^Wnt1-/-小鼠中观察到了类似的趋势（图2P）。因此，司美格鲁肽的部分肝脏保护效应，包括脂肪变性、纤维化和免疫重塑的改善，是通过不依赖体重减轻的机制介导的。

图2. 司美格鲁肽改善Glp1r^Wnt1-/-小鼠的脂肪变性、纤维化和免疫重塑

辅图2 司美格鲁肽改善患有MASH的Glp1r^fl/fl小鼠的脂肪变性、纤维化及免疫重塑

3.肝脏中央静脉周围肝窦内皮细胞上的GLP-1受体，是司美格鲁肽发挥保肝作用所必需的。

接下来，研究人员使用GEM-X Flex-seq（10× Genomics）单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术对来自野生型（WT）小鼠肝脏的单细胞悬液进行了Glp1r表达的分析。研究人员鉴定出17种转录水平上不同的肝脏细胞群体，包括肝细胞、LSEC、库普弗细胞/巨噬细胞、HSC，以及一系列淋巴系和髓系免疫亚群（图3A和图S3A）。Glp1r表达图谱显示其在LSEC和CD8⁺ T细胞中有离散表达（图3B），其中最显著的信号定位于内皮细胞区室（图3C）。共表达分析揭示了存在共表达Pecam1（CD31）和Cd3e/Cd3d的不同Glp1r⁺细胞（图S3B和图S3C），这与在分选的肝脏CD45⁻CD31⁺内皮细胞和CD45⁺CD3⁺ T细胞中Glp1r mRNA富集的结果一致。（小编注：CD31（又称 PECAM1）是公认的内皮细胞特异性标志物，可稳定表达于肝窦内皮细胞表面，用于内皮细胞的识别与分选；而 Cd3e/Cd3d 是成熟 T 细胞谱系的核心特征基因，仅在 T 淋巴细胞中表达。本研究中 Glp1r 与两类标志物的共表达结果，从单细胞层面证实了 Glp1r 同时在内皮细胞与 CD8⁺T 细胞中表达，为药物靶向两类细胞调控肝脏免疫提供了分子基础）。

为了解析这些群体内部的异质性，研究人员提取了LSEC集群并进行了亚群分析，产生了7个转录水平上不同的内皮亚群（图3D），其中集群2是主要的Glp1r⁺群体（图3E）。值得注意的是，该集群表现出中央静脉周围LSEC的特征性转录谱，表现为区域化标志物Wnt2、Wnt9b、Kit、Rspo3和Cdh13的选择性富集以及区域化评分（PP-PC）（图3F和图S3D–S3F），这是一个针对3区LSEC描述的基因特征。（小编注：PP-PC即门静脉-中央静脉肝小叶分区，肝组织沿门管区向中央静脉划分为1/2/3区。其中，中央静脉周围（3区）的肝窦内皮细胞（LSEC）被证实特异性高表达 Wnt2/Wnt9b/Rspo3等Wnt通路基因，这一表达谱已成为国际通用的 3区 LSEC分子分型标志物。本研究中转录组数据佐证了Glp1r⁺内皮细胞与这一中央区特征表达谱高度重合）相比之下，门静脉周围或中区特征的内皮亚群缺乏Glp1r表达（图3D–3F和图S3D–S3F）。最后，研究人员检测了肝损伤（CDHFD）或司美格鲁肽治疗（CDHFD_SEMA）是否改变了表达Glp1r的LSEC的区域分布或身份。虽然LSEC亚型的相对比例在不同条件下发生了变化，在CDHFD中门静脉EC比例增加而中区LSEC减少，这一变化被司美格鲁肽恢复正常（图S3G），但Glp1r表达本身仍然局限于中央静脉相关的LSEC。尽管在CDHFD中Glp1r⁺ LSEC的比例略有降低（从55%降至47%），并因司美格鲁肽治疗而恢复（54%），但Glp1r表达的中央静脉周围定位在不同条件下均得以保留（图3G和3H）。这些结果确定中央静脉周围LSEC是主要的肝脏Glp1r⁺细胞类型（图S3H）。（请在拓展阅读介绍这三种EC在特征和功能上有何不同）

接下来研究人员分析了T细胞区室。对CD8⁺ T细胞群体的重新聚类揭示了13个不同的亚群（图3I），其中集群0富集了Glp1r表达（图3J）。该集群的特征是耗竭相关基因（包括Pdcd1（PD-1）、Havcr2（TIM-3）、Tox和Nr4a2）的上调（图3K），表明其转录谱与终末耗竭的CD8⁺ T细胞一致。值得注意的是，在所有条件下，CD8⁺区室内的Glp1r表达始终局限于耗竭T细胞（图3L）；然而，与CDHFD喂养（14.3%）或司美格鲁肽治疗（17.7%）条件相比，STD喂养小鼠中Glp1r⁺耗竭CD8⁺ T细胞的比例显著更高（43%）（图S3I）（小编注：在本研究的非感染性稳态或代谢背景下，耗竭T细胞并不等同于“病理细胞”。耗竭T细胞更多是T细胞在特定微环境下分化出的末端状态，它们的存在并不一定代表疾病严重，而是反映了T细胞受抗原刺激后的分化轨迹。STD小鼠体内炎症水平极低，总的CD8⁺ T细胞数量维持在基础水平。此时即使耗竭T细胞的绝对数量很少，但由于总T细胞基数小，其占比（43%）显得很高。CDHFD小鼠肝脏及全身处于强烈的慢性炎症状态，驱动CD8⁺ T细胞优先分化为KLRG1⁺的短效效应细胞或记忆前体细胞，而不是进入耗竭分化程序，虽然耗竭T细胞的绝对数量可能也有所增加，但远远不如效应T细胞的爆发式扩增，因此耗竭细胞被“稀释”了，占比大幅下降至14.3%。司美格鲁肽治疗组（17.7%）的比例介于STD和CDHFD之间。这是因为司美格鲁肽通过减轻体重、改善胰岛素抵抗和降低炎症负荷，部分逆转了CDHFD带来的效应T细胞爆发式扩增，使总T细胞池缩小，因此耗竭细胞的占比从14.3%回升至17.7%，但尚未恢复到STD的稳态水平（43%）。为了仔细审视Glp1r在这些肝脏非实质细胞中表达的相关性，研究人员研究了Glp1r^Tie2-/-小鼠。Tie2启动子（Tek）靶向内皮细胞（CD45⁻CD31⁺）（图S1B）以及造血谱系（包括T细胞（CD45⁺CD3⁺）），这通过来自Glp1r^Tie2-/-小鼠的全肝脏以及荧光激活细胞分选（FACS）分选的CD45⁻CD31⁺和CD45⁺CD3⁺细胞中Glp1r mRNA的耗竭得到证实（图S3J和S3K）。Glp1r^Tie2+/+和Glp1r^Tie2-/-雄性小鼠被喂食CDHFD 32周，并在使用血浆转氨酶水平确认肝损伤后并且在基线时体重相当，小鼠被随机分配接受每日生理盐水或司美格鲁肽治疗约10周（图3M）。

司美格鲁肽治疗使Glp1r^Tie2+/+和Glp1r^Tie2-/-小鼠中产生了明显的体重减轻，伴有脂肪量减少（图3N–3Q）。接受司美格鲁肽治疗的Glp1r^Tie2+/+小鼠的总肝脏重量和相对肝脏重量以及gWAT重量也减少了（图S3L和S3M）。在瘦体重、水分含量、iWAT或BAT重量方面未观察到变化（图3Q、S3L和S3M）。司美格鲁肽治疗还导致两种基因型小鼠的胰腺重量增加（图S3L和S3M）。

司美格鲁肽在Glp1r^Tie2+/+和Glp1r^Tie2-/-小鼠中降低了空腹血糖，并减少了OGTT期间的血糖偏移（图3R和3S）。总胆固醇、HDL、LDL和甘油三酯在治疗组和基因型组之间保持不变（图S3N）。尽管体重减轻和葡萄糖代谢改善相似，司美格鲁肽的肝脏保护作用在Glp1r^Tie2-/-小鼠中显著减弱。在Glp1r^Tie2+/+小鼠中，司美格鲁肽治疗后血清ALT和AST水平显著降低，而这种效应在Glp1r^Tie2-/-小鼠中减弱（图3T）。两种基因型小鼠的血清ALP和总胆红素水平均未因司美格鲁肽治疗而改变（图S3O）。组织学分析显示，司美格鲁肽显著降低了Glp1r^Tie2+/+小鼠的肝脏脂肪变性和纤维化，表现为油红O、天狼星红和Masson三色染色减少。相比之下，这些组织学改善在接受司美格鲁肽治疗的Glp1r^Tie2-/-小鼠中基本不存在，尽管体重减轻和葡萄糖代谢改善相当（图3U和S3P）。此外，司美格鲁肽治疗后，Glp1r^Tie2+/+小鼠的肝脏甘油三酯含量和羟脯氨酸显著降低，而Glp1r^Tie2-/-小鼠则没有（图3V和3W）。在接受司美格鲁肽治疗的Glp1r^Tie2+/+小鼠中，纤维化相关mRNA（如Col4a1）的肝脏水平降低，而在Glp1r^Tie2-/-小鼠中则没有，并且在两种基因型中均未检测到Col1a1、Tgfb1和Acta2表达的变化（图3X）。

研究人员还检测了与MASH相关的关键炎症和代谢基因，包括Cxcl1、Cxcl2、Fabp和Cd36。Cxcl1 mRNA水平在不同治疗组和基因型之间没有差异（图3Y）。已知协调肝脏免疫细胞募集的Cxcl2在Glp1r^Tie2+/+小鼠中被司美格鲁肽下调，但在Glp1r^Tie2-/-小鼠中没有。(小编注：Cxcl1与Cxcl2虽同为中性粒细胞趋化因子，但细胞来源存在显著分化；其中 Cxcl2、Fabp4、Cd36为肝窦内皮细胞（LSEC）特异性靶基因，其表达调控严格依赖内皮细胞GLP-1R信号通路，是司美格鲁肽抑制肝脏脂蓄积与中性粒细胞浸润的分子基础，而Cxcl1主要由肝脏免疫细胞（如巨噬细胞、成纤维细胞等）分泌，其表达调控不依赖内皮细胞GLP-1R信号通路，因此在本研究中，司美格鲁肽对Cxcl1的mRNA水平无显著调控作用。)类似地，编码一种由内皮细胞丰富表达和分泌的脂肪酸结合蛋白，也就是被认为是MASH进展介导物的Fabp4，在Glp1r^Tie2+/+小鼠中被司美格鲁肽强烈抑制，但在Glp1r^Tie2-/-同窝小鼠中没有。

最后，在Glp1r^Tie2+/+小鼠中司美格鲁肽降低编码脂质转运蛋白和炎症信号介导物的mRNA Cd36，但在Glp1r^Tie2-/-小鼠中没有（图3Y）。这些发现支持在MASH过程中，Tie2表达域内的GLP-1R信号在调节脂质摄取和炎症中起必要作用。

图3. 肝脏 Glp1r 表达是司美格鲁肽发挥肝脏保护作用的必要条件

辅图3 肝脏Glp1r表达及司美格鲁肽对组织生物测量学的影响及实验性MASH小鼠中Glp1r^Tie2+/+和Glp1r^Tie2-/-小鼠的血清生化指标

拓展阅读

三种LSEC在特征和功能上的不同

根据肝小叶从门静脉到中央静脉的轴线，肝窦内皮细胞（LSEC）主要分为三种区域亚型：门静脉周围LSEC（1区）、中间区LSEC（2区）和中央静脉周围LSEC（3区）。门静脉周围LSEC位于门管区附近，是血液入肝的首站。此区域的肝血窦较窄且更为弯曲，其内皮细胞的窗孔直径较大（约111 nm），但密度较低。特征标志物为Cdkn1c、Vwf、Sox17、Efnb2、Ltbp4、Dll4、Msr1，低表达 Wnt 通路基因。转录特点为高表达凝血、血管稳态相关基因，低增殖基因表达、低 Wnt 信号活性。功能上是外源物质第一道过滤屏障，作为血流最先接触的内皮，负责门静脉来源毒素、肠道微生物代谢物的初步清除；并且维持肝门部血管完整性，分泌促凝血、血管收缩因子，抵抗肠道内毒素冲击。

中间区LSEC位于1区和3区之间，其形态结构特征和功能也介于两者之间，是一个过渡区域。Stab1、Lyve1广谱基础 LSEC 标记中等表达， Wnt 家族无特异性富集。转录特点是肝小叶中间过渡群体，标志物无分区特异性。功能上是物质交换核心缓冲区，肝小叶物质交换主力，清除循环大分子、衰老蛋白、低密度脂蛋白，并且平衡促炎/抑炎信号，介导肝细胞与免疫细胞（巨噬细胞、NK 细胞）通讯。

中央静脉周围LSEC靠近中央静脉。此区域的肝血窦更宽、更直。其内皮细胞的窗孔直径较小（约105 nm），但密度更高，因此总孔隙率最高。Wnt2、Wnt9b、Rspo3、Kit、Cdh13是特征标记物，Wnt通路高度激活，唯一高表达 Glp1r 的肝脏内皮亚群。转录特点为Wnt/β-catenin 通路特异性富集，是肝脏 GLP-1 受体主要表达细胞。 功能上是脂质代谢、Wnt 信号、代谢激素感知中枢。首先Wnt通路调控肝细胞分区功能，特异性分泌 Wnt2/Wnt9b/Rspo3，维持肝小叶3区肝细胞氧化代谢、脂质分解功能，是肝小叶分区命运的核心信号。并且是唯一携带 Glp1r 的肝脏内皮，直接响应司美格鲁肽，参与调控肝脏脂代谢、肝脂质蓄积。中央静脉汇集全身回流血液，3区LSEC还负责清除循环游离脂肪酸、胆固醇。

参考文献：

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4.肝内 Tie2⁺ 细胞中的 GLP-1R 协调了脂肪变性和纤维化的消退以及免疫调节

肝脏Tie2⁺细胞中的GLP-1R协调脂肪变性和纤维化的缓解以及免疫调节。接下来，研究人员将Glp1r^Tie2-/-雌性小鼠分为三组：维持STD饮食的组、喂食CDHFD并用生理盐水治疗的组，以及喂食CDHFD并用司美格鲁肽治疗的组（图4A）。这一设计使研究人员能够评估CDHFD诱导的肝损伤程度，同时衡量司美格鲁肽的治疗获益幅度。与维持STD饮食的对照组相比，CDHFD喂养导致体重增加和脂肪量增加。司美格鲁肽逆转了这些效应，促进了体重减轻和脂肪量减少（图4B–4E）。与此同时，CDHFD损害了葡萄糖稳态，而司美格鲁肽显著改善了血糖控制（图4F和4G）。尽管体重和葡萄糖代谢有所改善，司美格鲁肽未能改善CDHFD在Glp1r^Tie2-/-雌性小鼠中诱导的显著肝损伤。CDHFD喂养导致血清ALT和AST水平显著升高，并伴有明显的肝脏脂肪变性和纤维化。然而，在Glp1r^Tie2-/-雌性小鼠接受司美格鲁肽治疗后，这些参数没有观察到改善（图4H和4I）。因此，即使体重减轻和血糖控制改善程度相当，Tie2⁺细胞中的GLP-1R活性对于司美格鲁肽的完全肝脏保护效应仍是必需的。

研究人员的数据表明，司美格鲁肽在Glp1r^fl/fl和Glp1r^Wnt1-/-小鼠中调节免疫细胞“面貌”，且不依赖于其对体重减轻的影响（图2和图S2），这促使研究人员评估Tie2⁺细胞内的肝脏GLP-1R表达是否是这些免疫效应所必需的。研究人员在STD、CDHFD和CDHFD+司美格鲁肽组的Glp1r^Tie2-/-小鼠中进行了基于流式细胞术的免疫表型分析。使用t-SNE投影的降维分析揭示了CDHFD诱导的免疫组成全局性变化，特别是T细胞的扩增和B细胞的减少，这与慢性炎症重塑一致（图4J）。定量分析证实，在喂食CDHFD的小鼠中B细胞比例显著下降，这些效应在司美格鲁肽治疗后仍然存在。在其他髓系亚群的相对丰度方面，各组之间未观察到变化（图4K）。

对T细胞区室的进一步解析揭示了CD8a⁺T细胞亚群的特异性改变。t-SNE密度图和定量分析表明，CDHFD喂养导致肝脏CD8a⁺T细胞扩增，这主要由效应记忆CD8a⁺T细胞的增加驱动（图4L和4M）。重要的是，司美格鲁肽未能逆转Glp1r^Tie2-/-小鼠中的这种富集，表明这需要Tie2⁺细胞内的GLP-1R信号。相比之下，在接受司美格鲁肽治疗的Glp1r^Tie2-/-小鼠中，中央记忆CD8a⁺T细胞的比例升高，表明尽管缺乏肝脏GLP-1R，该亚群仍得到部分恢复（图4L和4M）。各组之间未检测到总CD4⁺T细胞或其记忆亚群的变化（图4L–4N）。肝脏细胞因子水平分析显示，无论是否接受司美格鲁肽治疗，喂食CDHFD的小鼠中CXCL1/KC水平均呈升高趋势（图4O）。值得注意的是，TNF-α在CDHFD喂养的动物中显著升高，并且在Glp1r^Tie2-/-小鼠接受司美格鲁肽治疗后仍保持不变（图4P）。这些发现表明，在缺乏Tie2域GLP-1R信号的情况下，尽管司美格鲁肽促进了体重减轻并改善了葡萄糖代谢，但无法减轻关键的炎症介质（如TNF-α），同样也无法逆转肝脏脂肪变性或纤维化。

图4. 肝脏Tie2⁺细胞中的GLP-1R是司美格鲁肽改善脂肪变性、纤维化和免疫重塑所必需

5.AAV8 介导的选择性靶向降低 LSEC 中的 GLP-1R 表达

为了破坏肝脏EC中的GLP-1R信号，研究人员采用AAV8-Cre病毒方法实现肝脏中Glp1r的诱导性敲低。成年Glp1r^fl/fl小鼠维持CDHFD饮食及接受单次尾静脉注射AAV8-Cre来实现肝微血管内的靶向重组。注射后2个月，AAV8-Cre给药对体重、脂肪量、瘦体重或葡萄糖耐量没有影响（图S4A–S4C）。值得注意的是，肝脏中Glp1r mRNA水平下调，但在肝外组织（如胰腺、肺和肾脏）中没有变化（图S4D）。为了评估细胞类型选择性，研究人员从肝脏中进行了基于FACS的CD45⁻CD31⁺ EC和CD45⁺CD3⁺ T细胞分选（图S4E–S4I）。在CD31⁺EC中检测到Glp1r表达显著降低并同时伴有Cre表达上调，而CD3⁺ T细胞中Glp1r或Cre水平没有变化（图S4F–S4I）（小编注：病毒物理上确实会流经整个肝脏。但它不感染T细胞，而是特异性感染内皮细胞，根本原因在于AAV8血清型的天然趋向性（Tropism）与细胞表面受体的差异。病毒与细胞的接触效率完全不同，肝窦内皮细胞衬贴在血管壁内，接触时间充分。AAV8高效感染细胞主要依赖硫酸肝素蛋白聚糖（HSPG）以及整合素（如αVβ5）等共受体,静息状态下的T细胞表面几乎不表达AAV8所需的这些关键附着受体（HSPG和特定整合素）。此外静息T细胞没有分裂，核膜完整，AAV8很难突破核孔复合物进入细胞核，AAV有效核运输比较困难）。

为了进一步证实AAV8-Cre对肝脏EC的选择性靶向，研究人员在Glp1r^fl/fl:Ai14小鼠中进行了类似的实验，在该小鼠中Cre介导的重组驱动永久的tdTomato表达。（小编注：Ai14小鼠基因组Rosa26位点携带tdTomato元件，无Cre时终止序列阻碍荧光基因表达；Cre介导loxP重组、切除Stop片段后，细胞永久表达tdTomato红光，实现重组细胞可视化标记。本实验仅CD31⁺LSEC出现荧光、CD3⁺T细胞阴性，结合前文分选qPCR的Glp1r转录下调数据，从荧光示踪+基因定量双层面共同证实AAV8-Cre仅靶向肝窦内皮，无T细胞脱靶）将小鼠分为三组：溶剂对照组、AAV8-GFP（对照病毒）组或AAV8-Cre组。成像流式细胞术显示GFP和tdTomato信号仅存在于CD31⁺ EC中，在CD3⁺T细胞中未检测到表达（图S4J–S4L）。从注射AAV8-Cre的Glp1r^fl/fl:Ai14小鼠中FACS分选的CD31⁺细胞显示Glp1r mRNA减少，而在CD3⁺细胞中表达保持不变（图S4M–S4O）。这两种互补的方法验证了肝脏EC的选择性靶向，从而能够在这个在解剖学和免疫学上至关重要的肝脏区室中精确解析GLP-1R信号的功能。

辅图4 AAV8-Cre介导的肝Glp1r下调及其机制的验证及实验性MASH对Glp1r^Wnt1-/-和Glp1r^fl/fl小鼠的代谢影响。

6.司美格鲁肽在 MASH中发挥肝脏保护作用，需要依赖肝脏内皮细胞上的 GLP-1R

接下来，研究人员研究了内皮GLP-1R信号在介导司美格鲁肽不依赖于体重减轻的肝脏获益中的功能相关性。研究人员将AAV8-Cre病毒导入Glp1r^Wnt1-/-雄性小鼠体内，这些小鼠在司美格鲁肽治疗下体重并未下降，但表现出部分肝脏保护作用（图1和图2）。通过在这个体重稳定的模型中选择性下调肝窦内皮细胞（LSEC）中的Glp1r，研究人员探索了内皮GLP-1R活性是否参与了司美格鲁肽的肝脏获益。给喂食CDHFD的Glp1r^Wnt1-/-小鼠注射AAV8-GFP或AAV8-Cre，并随机分组接受生理盐水或司美格鲁肽治疗（图5A）。各组间在体重、身体组成或器官重量（肝脏、附睾白色脂肪、腹股沟白色脂肪和棕色脂肪）上均未观察到差异（图5B–5E、S4P和S4Q）。尽管体重没有下降，司美格鲁肽仍改善了AAV8-GFP和AAV8-Cre治疗小鼠的葡萄糖代谢（图5F和5G）。各组间的血清脂质谱及ALT、AST、ALP、胆红素水平均无变化（图5H、S4R和S4S）。在Glp1r^Wnt1-/- AAV8-GFP小鼠中，司美格鲁肽减轻了肝脏脂肪变性和纤维化，但在接受AAV8-Cre的小鼠中则未观察到这一效果（图5I和S4T）。两组接受司美格鲁肽治疗的小鼠肝脏甘油三酯含量均同样降低（图5J），但羟脯氨酸含量及纤维化标志物Col1a1、Col4a1的肝脏表达水平呈下降趋势，而Tgfb1和Acta2仅在司美格鲁肽治疗的AAV8-GFP小鼠中降低（图5K和5L）。此外，在AAV8-GFP治疗的Glp1r^Wnt-/-小鼠中，司美格鲁肽抑制了肝脏Cxcl2、Fabp4和Cd36的mRNA表达，但这些效应在内皮Glp1r被AAV8-Cre下调后消失（图5M）。

接下来，研究人员在对司美格鲁肽表现出体重减轻反应的Glp1r^fl/fl雄性小鼠中靶向了肝脏EC。在给予AAV8-GFP或AAV8-Cre后，小鼠被随机分配接受每日生理盐水或司美格鲁肽治疗持续10周（图5N）。司美格鲁肽诱导的体重减轻在两组之间相当，AAV8-GFP和AAV8-Cre队列之间在身体成分或器官重量方面没有差异（图5O–5R、S4U和S4V）。类似地，司美格鲁肽在两组中均改善了血糖水平（图5S和5T）。血清脂质谱保持不变（图S4W）。然而，虽然司美格鲁肽降低了注射AAV8-GFP的小鼠的ALT水平，但这种效应在缺乏内皮GLP-1R表达的小鼠中减弱了（图5U）。在AST、ALP或胆红素水平方面未观察到变化（图5U和图S4X）。在组织学上，接受司美格鲁肽治疗的AAV8-GFP小鼠表现出纤维化和脂肪变性的减少，而这些改善在注射AAV8-Cre的小鼠中减弱了（图5V和图S4Y）。肝脏羟脯氨酸呈降低趋势，并且甘油三酯含量仅在接受司美格鲁肽治疗的AAV8-GFP小鼠中减少（图5W和5X）。司美格鲁肽在AAV8-GFP治疗的小鼠中还降低了Acta2、Cxcl1、Cxcl2和Fabp4的肝脏表达，但在AAV8-Cre组中没有（图5Y和5Z）。

为了证实这些发现，研究人员接下来将AAV8-Cre给予Glp1r^fl/fl雌性小鼠，并将其分为三组：STD组、CDHFD加生理盐水治疗组，以及CDHFD加司美格鲁肽治疗组（图S5A）。CDHFD喂养诱导了体重增加、脂肪量增加和葡萄糖代谢受损。值得注意的是，尽管AAV8-Cre导致肝脏内皮Glp1r下调，司美格鲁肽仍逆转了所有这些代谢异常（图S5B–S5G）。在接受生理盐水治疗的CDHFD小鼠中，血清ALT和AST水平显著升高，而在接受司美格鲁肽治疗的动物中，这些水平部分减弱（图S5H）。组织学分析显示，在接受AAV8-Cre给药并接受司美格鲁肽治疗的小鼠中，肝脏纤维化或脂肪变性没有改善（图S5I）。

通过t-SNE密度图和定量分析对肝脏免疫细胞进行免疫表型分析，结果显示，CDHFD喂养小鼠中肝脏总T细胞增加，经过司美格鲁肽治疗后这些细胞仍部分维持在较高水平。CDHFD喂养显著减少了B细胞，司美格鲁肽治疗后出现轻度恢复，但未回到对照水平（图S5J和S5K）。其他免疫细胞群体基本保持不变。CDHFD喂养小鼠中CD8a⁺T细胞升高，且未被司美格鲁肽恢复正常。值得注意的是，由CDHFD喂养诱导的初始和中央记忆CD8a⁺T细胞的丢失未被司美格鲁肽挽救（图S5L和S5M）。CD4⁺T细胞数量在CDHFD条件下减少，中央记忆CD4⁺T细胞也相应减少，这些发现同样不受司美格鲁肽的影响（图S5L–S5N）。尽管使用了司美格鲁肽，肝脏中CXCL1/KC和TNF-α蛋白水平仍然升高（图S5O和S5P）。这些发现表明，内皮GLP-1R信号是司美格鲁肽局部肝脏作用的关键介质，有助于MASH的缓解。

图5. 通过AAV8-Cre递送下调内皮细胞中的肝脏Glp1r表达可减弱司美格鲁肽介导的肝脏保护作

辅图5：司美格鲁肽在注射AAV8-Cre并喂食CDHFD的Glp1r^fl/fl小鼠中对脂肪变性、纤维化和肝脏免疫调节的影响

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