Cell：老年痴呆这点事，肝说“酶”问题

初稿 | 吴世林 

校对 | 胡敏

小编注 | 陈芳芳 胡敏 吴世林 武霞 张俊

排版 | 吴世林 

编辑 | 孟美瑶

背景介绍

运动能够逆转在衰老过程中大脑出现的诸多细胞和分子层面的典型变化，这对长期以来认为年龄相关的认知功能障碍是不可逆过程的传统观点提出了挑战。海马作为一个对记忆至关重要且对衰老损害极为敏感的大脑区域，运动可以增强老年小鼠的再生能力、促进突触可塑性、减轻神经炎症，并提升相应的认知功能。同样，在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）病理的动物模型中，运动也被证实可以改善学习与记忆能力。对于人类而言，增加身体活动与降低痴呆风险、减缓随年龄增长的认知衰退，以及推迟痴呆的发病时间（即使在常染色体显性遗传的AD中也是如此）都存在关联。然而，由于身体机能下降和其他医疗方面的限制，该方法在老年人中并没有得到持续的应用。因此，寻找能够在不进行体力活动的情况下，就可以获得运动所带来的认知益处的新方法，可能提供一条独特且尚未探索的治疗方法。

有研究团队近期证明，将运动后小鼠的血浆输注给久坐不动的小鼠，可将运动对衰老大脑的益处传递给后者，且该过程独立于身体活动。研究人员从中鉴定出一种由肝脏分泌的、可降解糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol , GPI）的酶（小编注：GPI，glycosylphosphatidylinositol，不是蛋白质本身，而是一种复杂的糖脂结构。它可以看作一个“分子锚”，将许多重要的蛋白质固定在细胞膜上。这类被它锚定的蛋白质，统称为“糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白”（GPI-AP））——即糖基磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D1（glycosylphosphatidylinositol specific phospholipase D1, GPLD1）（小编注：GPLD1的已知功能就是特异性切割GPI锚。它水解GPI锚中磷脂酰肌醇上的一个特定磷酸二酯键，从而将整个GPI锚定蛋白从细胞膜上释放出来。这个看似简单的切割反应，却能深刻改变目标蛋白的定位和功能，从膜结合形式转变为可溶性形式，进入细胞外环境发挥作用），这是一种由运动诱导的循环血液因子。尽管研究者已证明给予GPLD1能显著改善老年小鼠的认知功能，但GPLD1的潜在底物多达100余种GPI锚定蛋白。因此，要深入挖掘肝脏来源的GPLD1在脑衰老方面的治疗潜力，关键的一步是识别出在它下游、具体介导认知恢复效应的细胞和分子靶点，以便将相关发现转化应用于AD等痴呆相关神经退行性疾病的治疗。有趣的是，研究者发现提高系统中GPLD1的水平虽然改善了认知，但它本身并不能轻易进入大脑，这提示其作用机制涉及尚未阐明的外周途径。

为了探寻GPLD1下游的关键因子，研究人员结合生物信息学分析和靶向候选基因检测方法，发现位于脑血管上的GPI锚定蛋白——组织非特异性碱性磷酸酶（TNAP）是GPLD1的一个底物，并且该蛋白在衰老过程中表达显著上调。模拟随年龄增长而增加的脑血管TNAP表达，会损害年轻小鼠的血脑屏障（BBB）功能和认知能力，同时削弱GPLD1对老年小鼠的认知改善作用。反之，在老年小鼠中通过药物抑制TNAP的活性，则能够重现GPLD1所带来的转录组水平和认知功能的积极影响。研究者在AD病理模型（5xFAD小鼠）中发现，运动同样能诱导肝脏GPLD1的表达升高；与健康的年轻人相比，无论是正常老年人还是AD患者，其大脑中的TNAP水平均有升高。更重要的是，无论是增加肝脏GPLD1的表达，还是直接抑制TNAP的活性，都能逆转与AD相关的海马体转录组特征、减轻Aβ病理，并改善认知缺陷。这些发现共同表明，脑部血管系统是肝脏来源的运动血液因子恢复认知功能的重要介质。

敲黑板啦！

1. 肝脏运动因子GPLD1靶向衰老脑血管系统上的GPI锚定蛋白

2. 脑血管内皮细胞上的GPI锚定蛋白TNAP破坏血脑屏障并损害认知功能

3. 增加GPLD1或抑制TNAP可使衰老中血脑屏障功能和认知恢复年轻态

4. 增加GPLD1或抑制TNAP可改善阿尔茨海默病病理

研究结果

1、在衰老的海马血管中，GPI锚定蛋白TNAP是GPLD1的一个底物

首先，研究人员验证了与久坐对照组相比，老年小鼠在自主运动干预后，其肝脏中的GPLD1表达水平有所升高（图S1A-S1E）。随后，研究人员采用水动力尾静脉注射（Hydrodynamic Tail Vein Injection，HDTVI）介导的过表达技术（小编注：HDTVI（Hydrodynamic Tail Vein Injection，水动力尾静脉注射） 是一种专门用于在小鼠体内高效地将外源基因（如质粒DNA）递送到肝脏的特殊注射技术，通过快速注入大体积溶液会导致小鼠心脏暂时超负荷，迫使血液逆流回肝静脉。这股强大的液体压力会使肝脏的毛细血管（肝血窦）内皮细胞上的小孔暂时扩大，甚至让肝细胞膜出现可修复的微小破口，从而让溶液中的DNA直接进入肝细胞内部。文章方法中提到通过水动力尾静脉注射在体内肝脏中过量表达。水动力尾静脉注射时，使用无内毒素试剂盒制备无内毒素质粒。小鼠置于约束器中，将GPLD1、H133N或GFP质粒DNA（50μg）悬浮于3mL无菌生理盐水中，于5-7秒内注入尾静脉。），在老年小鼠肝脏中模拟了运动诱导的GPLD1升高。研究者通过新物体识别（Novel Object Recognition，NOR）和Y迷宫测试，评估了小鼠的健康状况和海马体依赖的记忆功能（图S1F-S1L）。结果显示，年轻对照小鼠在NOR和Y迷宫测试中分别对新物体和新臂表现出明显的探索偏好，而老年对照小鼠则无此偏好（图S1G，S1H）。然而，经过GPLD1治疗的老年小鼠，其与年龄相关的认知功能障碍得到了逆转（图S1G，S1H）。为了鉴定潜在的下游细胞和分子靶点，以阐明肝源性GPLD1介导认知功能恢复的作用机制，他们重点分析了候选的GPI锚定蛋白。研究者首先利用公开的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据库，对148种候选GPI锚定蛋白在不同组织中的细胞表达分布进行了分析（图1A，表S1）。通过分析发现，GPI锚定蛋白在血管内皮细胞和上皮细胞上高度富集（图1A），这提示血管可能是血液与大脑交界处GPLD1的潜在靶点。

接着，研究人员借助一个公开的年轻和老年小鼠RNA-seq数据集，分析了脑内皮细胞（Brain Endothelial Cells，BECs）中GPI锚定蛋白随年龄变化的表达差异。研究人员鉴定出11个上调和2个下调的基因，其中碱性磷酸酶生物矿化相关基因（alkaline phosphatase, biomineralization associated, Alpl，编码TNAP）是随衰老进程上调最为显著的基因之一（图1A，1B）。尽管TNAP的确切功能尚未完全阐明，但它作为四种碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, AP）同工酶之一，其经典功能是促进组织矿化和血管钙化（小编注：TNAP促进组织矿化的经典功能，主要服务于骨骼的正常生理性矿化（骨形成）过程，而其促进血管钙化的功能则是在动脉粥样硬化、慢性肾脏病或衰老等疾病状态中被发现的）。近期有研究表明，衰老过程中脑血管TNAP的增多会损害血脑屏障的物质运输功能，而抑制TNAP则可使这种运输能力恢复年轻化。基于此，研究者决定探究血管TNAP是否为GPI锚定型GPLD1的底物。

在海马区，研究人员观察TNAP在血管上的表达和AP活性染色呈现年龄相关性增加（图1C-1E，S1M，S1N）。在其他脑区也观察到了类似的增加现象（图S2A，S2B）。此外，与久坐的老年小鼠相比，经过运动的老年小鼠其脑血管中的TNAP表达和AP活性均有所下降（图1F-1H），但海马组织中Alpl的mRNA水平并未改变（图S1O）。

为了探究TNAP是否是GPI锚定型GPLD1底物，研究人员首先在体外进行验证。已知GPLD1的催化活性依赖于His133和His158残基，将这两个位点的其中一个残基替换为天冬酰胺（H133N或H158N）均可使其失活，研究人员利用已知GPLD1底物ALPP的裂解报告检测验证了这一点（图S2F）（小编注：ALPP 是 Placental Alkaline Phosphatase（胎盘型碱性磷酸酶） ，它是一种内源性的GPI锚定蛋白，在自然状态下，ALPP通过一个GPI锚牢牢地固定在细胞膜的外表面，具有非常稳定的酶活性，当它的GPI锚被GPLD1切割后释放到培养基中时，可以检测培养基中碱性磷酸酶的活性）。随后研究人员构建了组成型表达TNAP的报告细胞系，通过检测上清液中的AP活性即可评估其裂解情况，其活性反映TNAP在裂解后从质膜释放的过程（图1I）。研究人员分别用小鼠或人的GPLD1、无催化活性的H133N或H158N突变体GPLD1，以及绿色荧光蛋白（GFP）对照来处理这些TNAP报告细胞（图1I，S2G）。结果显示，只有经小鼠或人的GPLD1处理的上清液中，TNAP介导的AP活性显著提高，而失去催化活性的突变体及GFP对照则无此效果（图1J，S2G），这证实了TNAP是GPI锚定型GPLD1的直接底物。

为了验证血管TNAP是否为体内GPI锚定型GPLD1的底物，研究人员通过增加老年小鼠肝脏GPLD1的表达，观察海马区血管TNAP的表达和碱性磷酸酶活性的变化（图1K）。将表达GPLD1、无催化活性的H133N突变型GPLD1或GFP的表达载体通过HDTVI注射至衰老雄性小鼠体内，随后测定海马血管中的TNAP表达水平及碱性磷酸酶活性（图1K-1M）。结果显示，与H133N GPLD1或GFP对照组相比，肝源性GPLD1水平升高显著降低了海马区血管中的TNAP蛋白水平及其AP活性（图1L，1M）。肝源性GPLD1同样降低了其他脑区的AP活性（图S2C，S2D）。值得注意的是，研究人员发现的GPLD1处理并未改变老年小鼠海马体中Alpl的mRNA水平（图S1P），说明观察到的TNAP蛋白下降并非源于mRNA水平的变化。此外，他们在另一组老年小鼠中，通过独立测量血浆中循环TNAP的水平（分别在基线状态和肝源性GPLD1急性表达后），观察到循环TNAP水平的升高（图S2H，S2I）。由于循环中的TNAP必然来源于细胞膜上被切割下来的蛋白，这一结果为体内TNAP被GPLD1切割提供了进一步的证据。综上所述，这些数据表明，脑血管中的TNAP确定为GPI锚定型GPLD1底物。

图1 | GPI锚定蛋白TNAP是老年海马血管中的GPLD1底物

图S1 | 增加肝源性GPLD1可恢复老年小鼠的认知和健康指标

图S2 | TNAP/ALPL在不同年龄段、干预措施及组织中的表达与裂解特征分析

2、增加肝源性GPLD1可恢复衰老海马区血脑屏障（BBB）功能

鉴于已确定了TNAP是GPLD1的底物，并考虑到衰老过程中脑血管TNAP表达升高会导致血脑屏障功能障碍，研究人员接下来聚焦于增加肝源性GPLD1对衰老海马区血脑屏障功能的影响（图2A）。研究者通过眼球后静脉注射，对老年小鼠分别注射了编码GPLD1和H133N GPLD1的肝脏特异性腺相关病毒（AAV）（图2A，S2E）。同时，为建立血脑屏障功能随年龄变化的基础对照，本研究额外纳入一组年轻小鼠对照组，通过眼球后注射方式给予其肝脏特异性AAV载体（编码H133N GPLD1）（图2A）。他们评估了多个高度血管化组织中的GPLD1表达，并观察到GPLD1仅在肝脏中选择性增加，这进一步验证了AAV递送方法的特异性（图S2E）（小编注：从解剖学角度看，啮齿动物的眶后静脉丛与颅内静脉系统存在直接联系，这使得通过该途径注射的药物能够快速进入体循环系统。同时，由于注射部位远离主要神经干和动脉血管，操作风险相对可控。与尾静脉注射相比，其操作难度更低，适用于各年龄段的小鼠，注射成功率较高。在本文中，作者使用肝脏特异性启动子TBG（Thyroxine Binding Globulin，甲状腺素结合球蛋白）并搭配具有天然嗜肝性的AAV8血清型来构建AAV载体。当AAV病毒通过血液循环到达肝脏后，只有肝细胞内的转录机器能识别并启动该启动子，从而驱动GPLD1基因在肝脏中特异性高表达，而在其他器官中几乎不表达，从而实现肝脏特异性表达GLPD1。）。

为评估血脑屏障的通透性，研究人员给部分小鼠全身注射了小分子示踪剂N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide, NHS）-生物素（图2B）。结果显示，与年轻对照组相比，老年对照组小鼠海马区血管外出现了大量NHS-生物素渗漏区域，这与衰老过程中血脑屏障功能障碍一致（图2B）。然而，肝源性GPLD1的增加导致老年海马区域内血管中NHS-生物素渗漏量显著降低（图2B）。

据报道，在衰老的脑血管系统中，也存在从受体介导的转运向小窝转胞吞作用的转变。为评估受体介导的转运过程，研究人员给部分小鼠注射了荧光标记的经典配体转铁蛋白（TF-647）（图2A，2C）。与年轻对照组相比，老年小鼠海马区TF-647转运能力随年龄增长而下降，但这种年龄相关的下降在GPLD1处理的老年小鼠中得到了部分缓解（图2C）。接着研究人员通过检测Caveolin-1（Cav1）的表达来评估配体非特异性的小窝蛋白介导的胞吞转运，Cav1是一种随年龄增长而增加的小窝结构蛋白。结果显示，老年小鼠海马区血管上的Cav1表达高于年轻对照组，而肝源性GPLD1升高的老年小鼠，其血管上的Cav1表达则显著降低（图2D）。综上，这些数据表明肝源性GPLD1的水平升高可以改善老年海马区的血脑屏障功能。

为深入探究肝源性GPLD1升高在BECs中诱导的分子变化机制，研究人员进行了单细胞测序。研究人员从表达肝源性GPLD1或H133N GPLD1的老年小鼠海马区，以及表达肝源性H133N GPLD1的年轻小鼠海马区分离出BECs（图2E）。鉴定出了动脉、毛细血管和静脉内皮细胞群（图2F，S3A-S3E）。他们发现，随着年龄增长BECs发生了显著的转录变化（图2G），其中超过38%的改变在增加肝源性GPLD1后恢复至年轻化特征（图2G）。接着研究人员重点分析了那些在衰老中发生改变、又能被GPLD1治疗恢复的DEGs（图1G），S3F-S3H）（小编注：图2G主要量化了老年小鼠接受GPLD1治疗后，其脑内皮细胞（BECs）的转录组在多大程度上恢复了“年轻化”特征。左侧的Venn图显示了Aging组和GPLD1处理组的BECs的差异表达基因（DEGs）数量。右上饼图显示了Aging组和GPLD1处理组之间重叠的687个的DEGs，按单向变化与双向变化分开。单向变化：指一个基因在“衰老”和“GPLD1治疗”两个过程中的变化方向一致；双向变化：指一个基因在“衰老”和“GPLD1治疗”两个过程中的变化方向相反。Aging组和GPLD1处理组之间的重叠双向DEGs被称为“复年轻化特征”。底部散点图显示了Aging组（x轴）与GPLD1处理组（y轴）之间的重叠基因）。GO富集分析显示，这些差异表达基因主要参与炎症反应、能量代谢和蛋白质稳态等生物学过程（图2H）。这些单细胞转录组数据表明，增加肝源性GPLD1能够在一定程度上使老年海马体中BECs转向为更年轻的转录特征。

图2 | 增加肝源性的GPLD1可恢复衰老海马区血脑屏障功能

图S3 | 年轻、衰老、GPLD1和TNAPI处理的老年小鼠BECs的分离和scRNA-seq基因特征

3、模拟年龄增长而增加的脑血管TNAP水平会损坏海马区血脑屏障功能和认知能力

尽管已有研究表明，衰老过程中脑血管中TNAP表达的升高会损害血脑屏障的正常运输，但其对认知功能的具体影响尚不清楚。因此，研究人员采用细胞类型特异性病毒介导过表达技术，评估了模拟脑血管TNAP表达随年龄增长而增加对年轻小鼠血脑屏障功能及海马依赖性记忆的影响（图3A）。研究人员通过眼球后静脉注射（小编注：AAV有多种血清型，不同血清型对细胞或组织的感染效率差异显著。这是由于衣壳蛋白编码区的基因序列不同，导致其氨基酸序列和三维结构存在差异，进而产生不同的血清型。每种血清型的衣壳蛋白只能与特定细胞表面的糖类或受体结合，这种初始结合及随后与二级膜蛋白受体的相互作用，共同赋予了AAV不同的组织趋向性、转导效率、抗原性以及穿透细胞屏障的能力。同样采用眼球后静脉注射的方式，为何有的实验只影响肝脏，有的却能直接改变海马血管？核心区别在于所使用的血清型不同。在前面的实验中，为了在肝脏过表达GPLD1，研究者选择了AAV8血清型，并搭配肝脏特异性TBG启动子。AAV8对肝细胞有天然高亲和力，注射后病毒主要被肝脏摄取，因此目的基因仅在肝脏中高表达，不会直接在大脑中表达。而在后面的实验中，为了直接改变海马血管内皮细胞中的TNAP表达，研究者使用了PHP.V1血清型。这是一种经工程改造的AAV变体，具有强大的血脑屏障穿透力和对脑内皮细胞的强嗜性。同时搭配脑血管内皮细胞特异性启动子Ple261。这样一来，即使同样经血液循环进行传输，PHP.V1也能主动结合脑内皮细胞表面的受体（如LY6A），与启动子Ple261一起作用，感染海马等脑区的血管。因此，注射途径相同并不等于靶向效果相同，主要由病毒载体的血清型及其携带的启动子：AAV8血清型和TBG启动子倾向于肝脏，PHP.V1血清型和Ple261启动子则倾向于脑内皮细胞。这一差异使研究者能够在相同给药方式下，实现对不同器官或细胞类型的精准基因操控）给年轻小鼠注射了编码TNAP或mRuby2（Ruby）的BECs特异性AAV病毒，其中mRuby2作为对照（图3A，S4A-S4C）。注射AAV-TNAP后，海马体血管中TNAP蛋白及其AP活性均显著升高（图3B，S4C-S4E）。

随后，研究人员利用NHS-生物素示踪剂和荧光标记的转铁蛋白（TF-647）评估了血脑屏障功能（图3A）。结果显示，与年轻对照组相比，脑血管TNAP过表达的年轻小鼠海马区出现了更为显著的NHS-生物素血管外渗漏，同时TF-647的转运减少（图3C，3D）。与此同时，他们还观察到这些小鼠血管上的Cav1表达水平也升高了（图3E）。

研究人员通过NOR、Y迷宫和放射臂水迷宫（ radial arm water maze, RAWM）三种行为学方法，对小鼠的海马体依赖性记忆功能进行评估（图3F）。在NOR测试中，对照年轻小鼠对新物体表现出明显的探索偏好，而脑血管TNAP过表达的年轻小鼠则没有表现出这种偏好（图3G）。Y迷宫测试中两组小鼠未见显著差异（图3H）。在RAWM训练阶段，所有小鼠的空间学习能力相当（图3I）；但在随后的测试阶段，过表达TNAP的小鼠寻找隐藏平台的错误次数显著多于对照组，表现出学习和记忆障碍（图3I）。此外，两组小鼠的健康指标未见异常（图S4F-S4L）。这些结果表明，脑血管中TNAP的升高会损害海马区的血脑屏障功能，并对物体识别和空间记忆能力产生负面影响。

图3 | 模拟与年龄相关的脑血管TNAP增加会破坏BBB功能并损害认知能力

图S4 | 小鼠BEC表达TNAP后的表达分析和健康指标评估

4、恢复随年龄增长而增加的脑血管中TNAP水平会削弱肝脏来源GPLD1在老年期带来的认知益处

接下来，研究人员研究了通过恢复脑血管TNAP表达的年龄相关性增加，是否能够减轻老年小鼠肝脏来源GPLD1增加所带来的认知益处。老年小鼠接受了眼球后静脉注射，注射物为编码GPLD1的肝脏特异性AAV病毒以及编码TNAP或Ruby对照的BEC特异性AAV病毒（图4A）。作为阴性对照，将编码无催化活性的H133N GPLD1的肝脏特异性AAV和编码Ruby的BECs特异性AAV经眼球后静脉注射给老年小鼠（图4A）。在老年小鼠中通过病毒介导脑血管过表达TNAP后，观察到的GPLD1介导的血管TNAP蛋白和AP活性降低现象被逆转（图4B）。随后，研究人员通过NOR、Y迷宫和RAWM行为学方法评估了小鼠的海马体依赖性学习记忆能力（图4A-4E）。与接受H133N GPLD1治疗且表达血管Ruby的老年小鼠相比，肝源性GPLD1表达增加并表达血管Ruby的老年小鼠表现出对新物体和新臂的明显偏好，并且在RAWM任务中寻找隐藏平台的错误次数更少（图4C-4E）。然而，在脑血管过表达TNAP的老年小鼠中，GPLD1介导的认知益处在NOR和RAWM测试中被消除，但在Y迷宫测试中未见此现象（图4C-4E）。类似地，TNAP的表达消除了在接受GPLD1治疗的小鼠中观察到的一些健康指标的改善（图S4M-S4S）。这些体内病毒介导的过表达和行为学数据表明，靶向GPI锚定型脑血管TNAP，可部分调节肝源性GPLD1增加对老年小鼠物体和空间记忆的认知益处。

图4 | 增加脑血管TNAP会减弱肝脏来源GPLD1对认知的益处，而靶向抑制TNAP则可逆转与衰老相关的认知损伤

5、靶向脑血管TNAP可逆转衰老相关的认知损伤

为了探究选择性靶向干预与衰老相关的脑血管TNAP表达增加对认知功能的影响，研究人员使用一种病毒介导的体内CRISPR-Cas9方法，生成了老年时期可诱导的、BEC特异性的条件性Alpl基因敲除小鼠。对携带Cas9的老年小鼠注射BECs特异性AAV，该AAV表达Cre重组酶以及靶向Alpl基因或对照位点的gRNA（图4F，S5A，S5B）。注射后，海马血管系统及其他脑区均观察到AP活性的显著降低（图4G，S5C，S5D）。随后，研究者通过NOR、Y迷宫和RAWM行为学方法对小鼠的认知功能进行评估（图4F）。结果显示，与老年对照组相比，BECs特异性的TNAP敲除小鼠在NOR测试中对新物体表现出显著偏好，在RAWM测试中寻找隐藏平台所犯的错误也明显减少（图4H，4J）。虽然在Y迷宫测试中各组之间没有观察到差异，但在条件性敲除小鼠中观察到了整体健康指标呈现选择性改善（图4I和S5E-S5I）。

接下来，研究人员通过一种更具治疗可行性的药理学方法，将老年小鼠肝源性GPLD1水平升高带来的认知益处，与抑制随年龄增长而增加的血管TNAP活性的效果进行了比较。研究人员给注射表达H133N GPLD1的老年小鼠，在饲料中添加一种口服有效的、且不穿过脑屏障的TNAP抑制剂（TNAPi）SBI-425或溶剂对照（图4K）。研究人员将注射表达GPLD1基因的载体并喂食对照组食物的老年小鼠作为GPLD1介导认知益处的阳性对照组（图4J）。TNAPi处理后，海马血管中AP活性降低（小编注：血脑屏障（BBB）由脑毛细血管内皮细胞构成，它有两个面：腔面（luminal side）：朝向血液，直接暴露在血液循环中，基底面（abluminal side）：朝向脑实质，有研究显示，脑毛细血管的TNAP活性仅集中在内皮细胞的腔面（面向血液侧），因此不能透过血脑屏障的抑制剂，仍可在血液循环中直接接触并抑制TNAP，进而影响海马血管功能，无需进入脑实质。（Nwafor et al., 2021）（图4L）。行为学测试结果表明，与老年对照组相比，无论是接受TNAPi治疗还是GPLD1过表达的小鼠，均在NOR任务中表现出物体记忆的改善，在RAWM任务中表现出空间记忆的提升，且两者的改善幅度相近（图4M，4O）。值得注意的是，虽然GPLD1处理改善了老年小鼠在Y迷宫测试中的工作记忆能力，但TNAPi处理并未产生此效果（图4N）。此外，两种干预方式均选择性改善了老年小鼠的部分健康指标（图S5J-S5P）。综上所述，这些行为学数据表明，靶向血管TNAP可在一定程度上挽救老年时期物体记忆和空间记忆功能，其效果可与增加肝源性GPLD1带来的认知益处相媲美。

图S5 | 评估病毒介导的脑血管TNAP敲除或TNAP抑制对老年小鼠健康指标的影响

6、抑制TNAP活性可重现肝脏来源GPLD1在衰老过程中海马体的转录特征

为了深入探究其作用机制，研究人员进一步结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞核RNA测序（snRNA-seq），系统比较了两种干预方式——即抑制血管TNAP活性与肝源性GPLD1表达上调后，在老年小鼠海马区域BECs及脑实质组织中诱导的细胞及分子变化（图5A）。

首先，研究人员从TNAPi处理的老年小鼠海马区分离出BECs，并且与老年对照组的BECs相比，TNAPi处理组的BECs表现出显著的转录变化（图5B，S3A-S3E）。研究者将分析聚焦于GPLD1处理和TNAPi处理后共同变化的DEGs，发现两者存在显著重叠：GPLD1处理组中高达65%的DEGs在TNAPi组中发生一致的变化（图5B，5C）。对这些共同DEGs进行的GO富集分析显示，它们主要富集于炎症过程、能量代谢和蛋白质稳态等生物学过程，表明两种干预方式在这些核心通路上具有相似效应（图5D，S3H，S3I）。研究人员进一步分析发现，在衰老、GPLD1处理和TNAPi处理三组中，有530个DEGs是存在重叠的，其中高达97.3%的基因在两种干预后均被“恢复”到年轻的表达水平（图5E）（小编注：研究人员通过将三组的测序结果取交集， Aging组（灰色圆）：年轻vs衰老，GPLD1组（蓝色圆）：衰老vs衰老+GPLD1处理，TNAPi组（红色圆）：衰老vs衰老+TNAP抑制剂处理，筛选出530个被GPLD1和TNAPi共同逆转的衰老相关基因，因此被定义为"Rejuvenated "（年轻化基因），右侧饼图对这530个年轻化基因做了进一步验证：97.3%：GPLD1和TNAPi两种处理让这些基因的变化方向完全一致（同向逆转衰老），2.7%：方向不一致，归为Other。也说明了两者在核心通路上具有相似效应）。在他们测序的数据集中，已鉴定出若干DEGs，如Vcam1和Ppia（环肽素A），此前已被报道与脑衰老和血管功能障碍相关（图5F）。这些单细胞数据共同表明，无论是增加肝源性GPLD1还是抑制TNAP活性，都能部分恢复老年海马BECs中更年轻的转录特征。考虑到改善脑血管功能障碍的干预措施已被证实可调节衰老大脑的神经炎症、再生和认知功能，研究人员接下来采用互补的snRNA-seq技术，分析脑实质中各类细胞的基因表达变化。

研究人员从三组老年小鼠海马体中分离细胞核进行snRNA-seq分析，分别是过表达肝脏特异性GPLD1处理组、TNAPi处理组，以及表达H133N GPLD1的对照组（图5A，5G）。共鉴定出22个细胞群，并比较了不同处理组间的细胞亚群分布（图5H，S6A-S6D）。与表达肝源性H133N GPLD1的老年对照组小鼠相比，经TNAPi处理或肝源性GPLD1表达上调后，老年小鼠海马区神经元和小胶质细胞中均检测到显著的转录变化（图5H和5I）。值得注意的是，TNAP抑制所诱导的转录变化中，约有30%与GPLD1过表达诱导的变化相一致（图5H，5I，S6E，S6F）。除此之外，研究人员发现海马体中的转录反应通过不同细胞类型编码，表现为上调和下调基因的组合，且DEGs在很大程度上具有细胞类型特异性（图5H，S6G-S6I）。对TNAPi组与对照组间DEGs的GO分析揭示了与突触可塑性相关的生物学过程，这与肝源性GPLD1过表达后的观察结果一致（图5J，5K，S6J，S6K）。

研究人员对与表达肝源性H133N GPLD1的老年对照处理小鼠相比，在TNAPi处理和肝源性GPLD1表达增加后均发生变化的保守DEGs进行重点分析显示，大多数保守的转录反应是细胞类型特异性的，其中小胶质细胞和兴奋性神经元群（海马结构，CA1/2/3）表现出最大的变化（图5I，S6E和S6I）。对DEGs的GO分析再次指向突触可塑性和行为相关生物学过程，这与在GPLD1和TNAPi处理组中观察到的认知改善相互印证（图4K-4O，5J-5N）。研究人员鉴于观察到小胶质细胞群中显著的基因表达变化，他们接下来通过检测补体成分1q（C1q）的水平来补充转录组学数据，C1q是一种小胶质细胞来源的补体因子，参与突触修剪且已知其水平随年龄增长而增加。结果显示，与对照组相比，无论是GPLD1处理还是TNAPi处理，老年小鼠海马体中的C1q表达均显著降低（图5O）。由于技术限制，他们的snRNA-seq未能有效捕获星形胶质细胞，因此研究人员通过免疫染色评估了海马体星形胶质细胞增生情况，结果显示，GPLD1和TNAPi处理组中胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protei, GFAP）的表达均呈下降趋势（图5P）。综上所述，这些数据表明，通过靶向抑制TNAP活性，能够在很大程度上重现肝源性GPLD1表达增加所诱导的老年小鼠海马体转录特征。

图5 | 抑制TNAP活性可重现GPLD1治疗对衰老海马转录特征的影响

图S6 | GPLD1和TNAPI处理的老年小鼠的snRNA-seq基因特征和表达变化

7、肝源GPLD1在运动中增加，并能挽救阿尔茨海默病病理模型中的海马转录特征

衰老是痴呆相关神经退行性疾病（如AD）的主要风险因素。基于此，研究人员接下来利用AD转基因小鼠模型，探究了肝源性GPLD1表达上调在改善AD病理及认知缺陷方面的转化潜力。他们首先选用了表达人源β-淀粉样前体蛋白（APP）和早老素-1（PSEN1）转基因的5xFAD小鼠模型，该模型在APP/PSEN1基因中携带五种与AD相关的突变，并且该转基因模型表现出相对早期的AD病理特征，其认知缺陷在正常衰老相关的认知衰退出现之前便已显现。研究人员试图利用5xFAD模型AD病理进展迅速的特性，来区分GPLD1对老年野生型（WT）小鼠中“衰老特异性损伤”的改善作用，与对年轻5xFAD小鼠中“AD病理”的改善作用——后者通常不具有与年龄相关的自然认知障碍（小编注：年轻5xFAD小鼠模拟的是AD特异性的早期病理认知缺陷，而不是正常衰老相关的认知障碍。5xFAD小鼠携带人源APP/PSEN1的5个家族性AD突变，在年轻（如2-4月龄）时就已出现显著的Aβ斑块和认知缺陷，而此时它们并未经历正常衰老。因此，用年轻5xFAD小鼠可以专门研究GPLD1对AD病理的改善作用，排除衰老因素的干扰。而老年野生型小鼠则用来研究GPLD1对衰老本身的影响。原文研究者想区分两种不同的损伤：（1）发生在老年野生型小鼠身上的衰老特异性损伤，与年龄增长导致的自然认知衰退有关，没有AD病理。（2）由β-淀粉样蛋白沉积等AD病变直接引起的AD病理损伤。所以，年轻5xFAD小鼠不模拟老年小鼠的认知障碍，它们模拟的是AD患者（无论老少）特有的病理认知障碍。正常衰老的认知障碍与AD病理引起的认知障碍，机制不同，研究者正是希望区分这两者），并给成年5xFAD小鼠进行为期3个月的跑轮运动（图6A）。通过NOR评估其海马体依赖性认知功能。结果显示，与久坐对照组相比，运动组5xFAD小鼠探索新物体的时间显著更长（图6B）。同时，运动组小鼠肝脏中GPLD1的表达水平显著升高（图6C），且该表达水平与NOR中的认知表现呈正相关（图6D）。这些结果表明，在成年5xFAD小鼠中，运动能够上调肝脏GPLD1的表达，并伴随认知功能的改善。

为深入探究肝源性GPLD1表达升高在5xFAD小鼠海马区引发的细胞和分子变化，研究者进行了snRNA-seq分析（图6E）。对三组小鼠进行了比较：注射GPLD1的5xFAD小鼠、注射GFP对照的5xFAD小鼠，以及注射GFP的同窝年龄相匹配WT对照小鼠（图6E）。共鉴定出20个细胞亚群，并比较了不同基因型和处理组间的细胞群分布（图6F，S7A-S7D）。与WT对照小鼠相比，研究人员在5xFAD小鼠海马体中的兴奋性神经元群体（特别是DG区和CA1区）中检测出显著的转录变化，同时在肝源性GPLD1表达增加后也观察到类似变化（小编注：这里的类似变化并不是指5xFAD引起的异常表达模式与GPLD1处理后的表达模式相同，而是指GPLD1处理后，在相同的细胞群体（兴奋性神经元）中，也检测到了显著的转录变化（即与WT相比存在差异表达）。这里是一种宏观描述，不涉及具体基因的方向。后面作者也用“30%恢复”的数据来说明两者实际的不同）（图6G）。在5xFAD模型检测到的转录变化中，有近30%在GPLD1处理后恢复到了接近野生型水平（图6G，6H，S7E，S7F）。并且他们发现在海马体中检测到的转录反应由不同细胞类型编码，其上调和下调基因组合在很大程度上具有细胞类型特异性（图6G，S7G，S7H）。对5xFAD小鼠及GPLD1处理后DEGs的GO富集分析显示，这些基因主要富集于神经发生和突触功能相关的生物学过程（图6I，6J，S7I，S7J）。

接下来，研究人员重点分析那些在5xFAD小鼠中表达改变，但经过GPLD1处理后恢复至接近野生型（WT）对照水平的DEGs（图6H，S7E，S7F）。这些被恢复的转录反应大多具有细胞类型特异性，其中以兴奋性神经元群（DG区和CA1区）的变化最为显著（图6H，S7E，S7K）。对这些DEGs进行GO富集分析显示，它们主要涉及神经发生和突触功能相关的生物学过程（图6K，6L）。与转录组学数据一致，研究人员在GPLD1处理的5xFAD小鼠海马体中观察到成体神经发生增强（表现为MCM2阳性神经祖细胞和双皮质素DCX阳性新生神经元数量增加），同时参与突触可塑性的神经营养因子——脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor , BDNF）的水平也明显升高（图6M-6O）。此外，对小胶质细胞群的分析显示，与对照组相比，GPLD1处理的5xFAD小鼠中多个疾病相关小胶质细胞（disease-associated microglia , DAMs）标志物以及既往报道在AD病理小鼠模型中高表达的炎症相关基因的表达水平均有所下降（图S7L）。最后，研究人员评估了海马区的星形胶质细胞增生情况，发现GFAP的表达水平显著降低（图6P）这些转录组学数据共同表明，增加肝脏来源的GPLD1能够有效恢复AD病理小鼠模型中诱导的海马转录特征。

图6 | 肝源性GPLD1在运动中增加，并能挽救阿尔茨海默病病理模型中的海马转录特征

图S7 | GPLD1处理的5xFAD小鼠的snRNA-seq基因特征和基因表达变化

8、在小鼠体内增加肝脏来源的GPLD1或抑制TNAP活性可改善AD病理和认知缺陷

已有研究证实，运动能够改善5xFAD阿尔茨海默病小鼠模型的病理状况，跑轮运动可以减少其脑内β-淀粉样蛋白的累积并提升认知功能。因此，研究人员评估了在过表达肝源性GPLD1的5xFAD小鼠、表达GFP的5xFAD小鼠，或表达GFP的野生型同窝对照小鼠的海马区Aβ病理变化和认知缺陷的情况（图7A）。结果显示，相较于仅表达GFP的5xFAD对照组小鼠，接受GPLD1治疗的5xFAD小鼠海马区内，硫黄素S阳性淀粉样蛋白沉积及Aβ的表达水平均显著降低（图7B-7E）。研究人员进一步对海马和皮层中的APP加工过程分析发现，C端片段水平降低，但全长APP的蛋白水平并未改变，这表明GPLD1处理的5xFAD小鼠中APP加工过程发生了改变（图S8A-S8J）。此外，研究人员评估了包括筑巢评分和基于海马记忆（通过NOR和Y迷宫测试）在内的多项功能指标，观察到GPLD1治疗后，5xFAD小鼠在筑巢行为、物体记忆和工作记忆方面均出现功能性改善（图7F-7H）。在另一组小鼠中，研究人员通过主动位置回避测试（小编注：Active place avoidance，APA是一种经典的海马依赖性空间学习与记忆任务。它的核心不是让小鼠去寻找奖励，而是让小鼠学会主动避开一个固定在外部空间坐标中的惩罚区（shock zone）。因为动物所在的平台在持续旋转，小鼠不能只靠自身运动轨迹或局部线索（如脚下的平台本身），而是要通过观察房间里固定不动的参照物，判断自己是否快被旋转到危险区域。因此这个任务对海马的空间定位、参照框架整合和学习记忆能力比较敏感。在本研究中，作者记录了小鼠进入电击区的次数、受到电击的次数及累计电击数。若小鼠空间学习能力较强，训练后这些指标应逐渐下降）评估其空间学习与记忆能力，发现5xFAD小鼠相较于野生型同窝对照小鼠存在功能障碍，而这种障碍在GPLD1治疗后得到了部分恢复（图S8K-S8N）。值得注意的是，肝源性GPLD1水平升高为5xFAD小鼠带来的这些功能性益处，其效果与同龄野生型小鼠的基线水平相当（图7F-7H和图S8O-S8R）。

为了探究介导GPLD1认知改善作用的下游靶点是否也能同样缓解AD病理，研究人员首先通过蛋白质印迹分析检测了老年人和AD患者脑组织中的TNAP表达水平，结果显示其表达量显著高于健康年轻人群（图7I、7J）。接下来，他们检测了经GPLD1处理的5xFAD小鼠海马区TNAP表达及AP活性的变化，发现与表达GFP的5xFAD小鼠相比，肝源性GPLD1增加后TNAP表达和AP活性均出现下降（图7K–7M）。因此，研究人员探究了在5xFAD小鼠中靶向TNAP活性对Aβ病理和认知功能的影响。将TNAP抑制剂或对照溶剂混入成熟5xFAD小鼠的饲料中进行给药。为评估阿尔茨海默病病理导致的基础变化，纳入了年龄匹配的野生型同窝对照小鼠并喂食对照饲料（图7N）。结果显示，与对照组相比，接受TNAPi治疗的5xFAD小鼠同样表现出硫黄素S阳性淀粉样沉积和Aβ表达的减少（图7O-7R），其筑巢能力和新物体识别记忆也得到了改善，但工作记忆未见显著提升（图7S-7U和图S8S-S8V）。综上所述，这些研究数据表明，无论是在阿尔茨海默病小鼠模型中增加肝脏来源的GPLD1，还是直接抑制其下游靶点——GPI锚定蛋白TNAP的活性，都能够有效减轻Aβ相关的病理变化并改善认知缺陷。

图7 | 在小鼠体内增加肝源性GPLD1或抑制TNAP活性可改善阿尔茨海默病病理及认知缺陷

图S8 | GPLD1处理的5xFAD小鼠中APP加工和健康指标的评估

总结  

血液因子可以不依赖于体力活动本身，将运动的益处传递给衰老的大脑。本研究发现，一种由肝脏产生的运动因子——糖基磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D1（GPLD1），一种GPI降解酶，通过靶向脑部血管系统，逆转了与衰老和阿尔茨海默病（AD）相关的记忆丧失。GPLD1具有切割超过100种假定GPI锚定蛋白的潜力，这要求研究人员鉴定出能介导认知年轻化的下游靶点，以实现转化应用。研究人员鉴定出了位于脑血管上的GPI锚定蛋白——组织非特异性碱性磷酸酶（TNAP）是GPLD1的一个底物。在年轻小鼠中模拟衰老过程中脑血管TNAP的升高，会损害其血脑屏障的物质运输功能和认知能力，并且会削弱GPLD1对老年小鼠的认知改善效果。而抑制TNAP的活性，则能重现GPLD1在老年期带来的益处，使海马体的转录特征恢复年轻状态，并挽救认知功能。在AD小鼠模型中，无论是增加GPLD1还是抑制TNAP，都能减轻Aβ病理并改善认知缺陷。综上，该研究揭示了脑部血管系统是连接肝脏与大脑这一运动轴、从而改善认知功能的关键介导者。

原文链接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(26)00111-X