编译：艾奥里亚，编辑：小菌菌、江舜尧。

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本研究采样点位于广东省茂名市（21°30′38.82″N, 111°0′37.27″E），该地区天然红树林群落主要以K. obovata为主。

本研究于2019年4月采集了6株单独的K. obovata树苗，并将其根系土壤分为非根际土壤（N）、根际土壤（R）、episphere（P）和endosphere（D）。

简而言之，我们采集红树植物的根，通过摇动将非根际土壤从根中分离出来。用无菌水冲洗，收集根际土壤（根围~1 mm厚）。随后将根部清洗三次，去除剩余的土壤，并置于含有0.1% TritonX-100的1*TE缓冲液中。然后，在添加0.1%TritonX-100的1*TE缓冲液中，通过洗涤和摇动收集episphere土壤样本。通过0.22μM膜过滤得到的悬浮液，进一步收集了episphere样本中的微生物生物量。

为了收集Endosphere微生物生物量，根部在80%乙醇中表面消毒1min，然后在0.25%NaClO中再次灭菌1min。所有4个根区样本都保存在-80°C下，用于后续DNA的提取和分析。

1 红树林根部四个不同区域内微生物群落的多样性和组成

基于16S rRNA及ITS基因扩增，我们对红树林根系相关细菌和真菌群落进行了分析，以探究微生物多样性在四个连续的细微尺度隔间内是否存在差异。通过分析我们发现，非根际（N）、根际（R）、episphere（P）和endosphere（D）四个区域内的细菌和真菌群落多样性存在很大差异（图1a）。其中，无论是细菌还是真菌群落，在endosphere中的Shannon指数和OTUs丰富度都最低。虽然外部三个根区（N、R和P）的真菌多样性指数相似，但就细菌多样性而言，非根际土壤（N）的细菌多样性高于其他区域。基于PCoA分析我们发现，四个区域的细菌和真菌群落分离良好（P<0.05，Adonis检验），endosphere样本与其他根区的样本明显分开（图1b）。

图1 四个红树林根区微生物多样性和富集/耗竭的OTUs。a 代表Shannon指数和丰富度的箱线图；b 代表基于四个不同的根区对真菌和细菌进行的主坐标分析（PCoA）；c 代表与非根际对照相比，在根际、episphere和endosphere区域的富集和消耗的细菌和真菌OUTs；d 代表每个根区中细菌和真菌的差异富集和耗尽的OTUs的数量，N，R，P，D分别代表非根际土壤，根际土壤，episphere以及endosphere。

本研究所检测到的OTUs分属于在7个优势细菌门。Proteobacteria的丰度从非根际（non-rhizosphere）到endosphere逐渐增加，而Chloroflexi的丰度则表现出相反的趋势。endosphere以Proteobacteria为主（69.83%），而Chloroflexi（7.93%）和Actinobacteria（4.24%）含量较低。正是由于endosphere中具有高度多样化的Proteobacteria存在，伴随着科水平上的主要优势细菌包括：两个α-proteobacterial科（Hyphommicrobiaceae和Rhodobacteraceae，分别为11.25%和5.24%），两个γ-proteobacterial科（Vibrionaceae和Saccharospirillaceae，分别为11.48%和2.94%），以及一个Delta-proteobacterial科（Desulfobulbaceae，占比10.72%）。在属水平上，我们还观察到四个根区之间的显著差异。endosphere中Vibrio和Saccharospirillum的相对丰度明显高于其他根区（P<0.05），而与其他根区相比，Desulfococcus、Desulfosarcina和Defluviitalea在endosphere中大部分被耗尽。与细菌群落相一致，真菌群落在四个根区之间也表现出显著差异（P<0.05）。在已知的真菌OTUs中，endosphere中Ascomycota（11%）和Basidiomycota（17%）的丰度均低于其它根区（Ascomycota：26%；Basidiomycota：22%）。对于其他未分类的真菌OTUs来说，我们同样在跨四个根部区域中发现了相同的变化趋势。

2 红树林根室四个根区中，富集或耗尽的微生物OTUs

进一步我们探究了导致四个根室微生物群落组成差异的OTUs。以非根际土壤为对照，以P=0.01为阈值，从外（根际，rhizosphere）到内（endosphere），细菌OTUs相似（R-P-D：1133-1258-1239），但真菌OTUs呈下降趋势（R-P-D：1163-934-732）。其中，被富集的细菌OTUs（R-P-D：466-592-975）和枯竭的真菌OTUs（R-P-D：514-472-246）的数量呈现完全不同的趋势。这种差异在endosphere表现的更加明显，与episphere和rhizosphere相比，endosphere中包含更多消耗殆尽的细菌OTUs（975），而细菌OTUs（264）和真菌OTUs（246）的富集程度较低（图1c）。

此外，我们还观察到四个根室中具有明显重叠和差异的OTUs。其中分别有73.9%和26.1%的根际富集细菌OTUs在episphere和endopshere内富集。同样，分别有53.7%和27.0%的根际真菌OTUs在episphere和endopshere内富集。这些数据表明，根际中的许多微生物能够在根部定居。除了这些重叠，我们在每个区域内还观察到了许多差异OTUs，这其中大部分根际中耗尽的OTUs都在episphere、endosphere或两者中都被耗尽了。例如，55.2%的细菌OTUs和77.8%的真菌OTUs在episphere被耗尽，在endosphere也被显著耗尽（P<0.05）（图1d）。总体而言，与根相关的细菌和真菌群落形成了四个空间上可分离的根区，它们具有截然不同和重叠的微生物分类群。

3 红树林根室四个区域中根相关微生物群落的功能

为了探索红树根系相关微生物群落的功能，我们利用鸟枪宏基因组测序技术对红树根系相关微生物群落进行了分析，我们将重点聚焦于碳、氮、硫和甲烷循环中关键功能基因和途径的相对丰度（图2）。基于Non-supervised Orthologous Groups （eggNOG），Carbohydrate-Active enZymes （CAZy）以及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）数据库，我们对宏基因组数据进行了注释，通过分析发现，与根相关的微生物群落的生态位分化伴随着四个根区之间微生物功能的显著差异（图2）。

首先，基于eggNOG的功能注释表明，参与碳水化合物运输和代谢（G）的基因在endosphere比在根际和episphere中更丰富（图2a）。参与次生代谢物生物合成、运输和分解代谢（Q）的基因在endosphere和episphere有所富集，但在根际和非根际被消耗。Endosphere，episphere以及根际由许多与脂质运输和代谢有关的基因（I）和信号转导机制（T）组成。通过对与碳循环密切相关的CAZy参考序列的分析（图2b），我们在endosphere中观察到在6个主要的CAZy家族中，其中碳水化合物酯酶（CE）、葡萄糖苷转移酶（GT）和糖苷水解酶（GH）基因被富集（图2b）。

其次，由于红树林沉积物的氮素限制会限制植物的生长和微生物的活动，我们探究了红树林根环境中参与氮循环的各种功能基因的丰度（图2c）。我们发现参与胞外聚合物转化为NO₃^-（nrtA/B/C）的基因相对丰度从根外到根内逐渐增加（N和D的基因转录量分别为1,572和2,986）。尽管涉及NO₂^-、NH₂OH和N₂转化的基因（分别为nirB、hcp和nifK）在四个根区域中富集（图2c），但与其他区域相比，endosphere中nifK（934）和nirB（2119）的丰度最高，而nirS的丰度较低（图2c）。

在硫循环相关基因中，土壤中soxB/A/C/Z/Y/X/D的平均丰度（7202）高于根际、episphere和endosphere的平均丰度（R-P-D：6702-6623-6651），表明根际附近S₂O₃^-转化为SO₄^2-的潜力降低。涉及sat，cysD，phsA和dsrB的功能基因，在endosphere中丰度最低，而在episphere中dsrA的丰度最低（图2d）。这些数据表明，非根际土壤和根际土壤的硫还原潜力可能更大。

此外，红树林生态系统被认为是重要的甲烷汇，因此我们估计了与甲烷生成和甲烷营养相关的功能基因的丰度（图2e）。通过分析我们发现，非根际甲基辅酶M还原酶基因（mcrA）的丰度在非根际土壤中（17）低于其在endosphere中的丰度（69），而颗粒甲烷单加氧酶（pmoA）的丰度最低（图2e）。endosphere中mcrA/pmoA（27）的比值最高，这表明红树根系具有很高的产甲烷潜力。综上所述，根系相关微生物群落在碳、氮、硫循环中可能起重要作用。更重要的是，四个红树根区域的代谢功能潜力有很大的不同。

图2 四种红树林根系组成微生物菌群的鸟枪宏基因组测序分析。a-b分别代表了EggNOG模块（a）和CAZy模块（b）的相对丰度，c-e分别代表涉及N循环，S循环和甲烷生产的关键基因。

4 根系分泌物可塑造红树林根系相关微生物群落

为了检验根系分泌物是否能够对红树根系相关微生物群落的多样性和组成起到调控作用，我们采用非靶向代谢组学分析方法，结合negative mode acquisition（NEG）和positive mode acquisition（POS）模块，对K. obovata根系分泌物的组成进行了测定。我们共鉴定出216种代谢物，这其中包括氨基酸、有机酸、多羟基酸、糖、磷酸盐、多元醇和N-化合物等（图3a）。NEG模块中鉴定出的最丰富的代谢物包括软脂酸（34.7%）、硬脂酸（16.4%）、脱氢枞酸（7.1%）、油酸（6.7%）和肉豆蔻酸（6.1%）；而在POS模块中鉴定出的代谢物包括dioctyl phthalate（43.7%）、三甲铵乙内酯（16.9%）、phthalic acid mono-2-ethylhexyl ester（11.4%）和ethyl 3-hydroxybutyrate（11.4%）。

Actinobacteria，Nitrospirae（固氮菌）和mycorrhizal真菌作为根相关微生物群落的成员，有研究发现这些微生物与一些脂肪酸（棕榈酸，亚油酸，油酸和硬脂酸）相关；因此，我们对这些微生物类群在四个根区中的相对丰度进行了比较。基于分析我们发现，Actinobacteria在episphere中的相对丰度（7.4%）显著高于其他区域（图3c），这证实了这样一个发现：Actinobacteria成员是受植物根系分泌物刺激的主要类群。同样，固氮菌也在根际和episphere中显著富集（图3d，e）。包括Firmicuts，Chloroflex和Ascomycota在内的其他与根系分泌物有关的微生物分类群，在episphere中也表现出显著富集的现象（P<0.05）（图1e）。以非根际为对照，我们发现episphere和根际中的Hyphomicrobium与根系分泌物中多种丰富的成分呈正相关。因此，我们提出红树林中的根分泌物可以影响许多与根相关的微生物种群，特别是那些栖息在episphere中的微生物类群。

图3 K. obovata根渗出的代谢物分析。a-b分别代表基于POS（a）和NEG（b）模块进行的非靶向代谢物分析，其中饼图显示了红树林根系中十大渗出物的相对丰度；c-d分别代表基于扩增测序，测定了四个根区中Actinobacteria（c）和Nitrospirae（d）的相对丰度；e代表基于qPCR技术测定了红树林四个根区中固氮细菌与细菌的比值。

5 红树林根室微生物群落的组装机制

为了了解红树林根系相关微生物群落的动态，我们结合了微生物来源分析和生态过程分析来阐明沿土壤根系连续根区的微生物获取方式。endosphere中的大部分细菌OTUs来自非根际土壤（74%），只有一小部分（4%）的episphere细菌群落在endosphere土壤中被检出（图4a）。此外，在endosphere土壤中没有检测到先前在非根际或episphere中检测到的真菌OTUs（图4b）。为了验证根部对细菌和真菌的不同获取方式，我们采用实时荧光定量PCR（qPCR）技术测定了4个根区中细菌和真菌的比例。结果表明，非根际土壤细菌/真菌比例由非根际的128.0%下降到endosphere的13.8%。此外，生态过程分析表明，异质选择的确定性过程对细菌和真菌的群落聚集的贡献率>40%（图4c）。综上所述，这些结果表明，在红树林根系相关微生物群落的组配过程中，episphere可以有效地起到调控微生物进入根际endosphere的大门的作用，显示出异质性选择的优势。

图4 沿土壤-根系连续空间内的微生物获取。a-b分别代表细菌（a）和真菌（b）在外部根区的source Tracker结果；c代表四个红树林根区中细菌和真菌的生态过程。

了解与根系相关的细微尺度上微生物群落的多样性和功能，对于阐明红树林生态系统中微生物的组装机制及其生态重要性至关重要。本研究中，我们分析了四个根区的微生物多样性及其功能，以及它们与根系分泌物的关系。我们的结果总体上支持这样一个核心假设，即红树林根系相关微生物群落的多样性和功能将沿着这种连续的细微生态位分化。红树林根部endosphere区细菌和真菌群落的多样性均低于其它区域，这与拟南芥根部微生物群的多样性相似。这表明根表面在控制微生物进入根部和减少微生物多样性方面具有选择性作用。

值得注意的是，与根相关的微生物群落的功能在不同的微环境或根区中表现出一定的模式。有研究发现，植物碳源和根系分泌物能够吸引特定的微生物种群进入根际或epsiphere，尤其是参与碳循环的微生物类群。碳循环需要一系列的碳水化合物活性酶，包括GTs。小麦根部环境中的一些GTs可以帮助抵抗病原真菌，而另一些GTs则具有自我解毒机制。此外，一些GT还能催化植物体内激素的活化，提高糖在根中的运输效率。与前人的研究结果一致，我们的研究表明，GTs的丰度从非根际、根际、episphere到endosphere逐渐增加，这表明根内微环境可能具有较高的糖转化效率和自我解毒潜力。

红树林生态系统的沉积物和根际都富含SRB。作为厌氧环境中有机物的重要分解者，SRB在红树林生态系统中有机硫的矿化和为其他生物生产有效铁和磷方面发挥着关键作用。相似的，我们发现与根相关的隔间具有丰富的SRB（如Desulfococcus和Desulfosarcina）和相关的功能基因（如phsA和dsrA）。更引人注目的是，SRB和硫还原相关基因在外部隔室中尤其的丰富。这可能是由于根际中存在氧和氧化还原电位梯度，进而促进了非根际和根际土壤中硫酸盐的还原。

红树林生态系统排放大量甲烷。已有的研究发现，CH₄排放受到甲烷菌（由mcrA鉴定）和甲烷营养菌（由pmoA鉴定）的显著影响。本研究中，endosphere的mcrA/pmoA的比值远远高于其他外部隔室，这表明endosphere比其他隔室有更高的CH₄排放潜力。尽管以前的研究把红树林沉积物认为是一个关键的甲烷汇，但这项研究表明，在红树林生态系统中，通过红树林根部产生甲烷，然后将其输送到地上植物中，可能是一种以前未被认识到的替代途径，这一现象在以前对Phragmites海岸盐滩的研究中已有所阐述。

红树林生态系统具有丰富的有机碳和高矿化度。在这种条件下，氨化细菌比反硝化细菌具有更高的亲和力，使异化硝酸盐还原为铵（DNRA）成为储存氮的主要途径。本研究中，与DNRA过程相关的基因在与根相关的隔室中被丰富。红树根系的3个内部区域中含有丰富的固氮微生物，可能富含氨氮。这些结果表明，四个根室的微生物多样性、丰度和功能存在差异。因此，endosphere具有较高的糖转化效率和自我解毒、CH₄排放和氨氮储备的潜力，而非根际和根际的硫酸盐还原作用强于episphere和endosphere。

根分泌物可以影响根环境中的微生物群落组成，特别是在episphere和根际微环境中。先前的研究表明，根分泌物可以起到招募各种功能微生物来保护寄主植物的作用。根分泌物中高丰度的酚酸可能导致促植物生长的根际细菌及其参与产生抗真菌物质的关键基因的高丰度现象。此外，根分泌物还能提供包括脂肪酸和糖在内的多种有机物，从而增加微生物生物量和多样性。在本研究中，我们发现红树林的根系分泌物包括氨基酸、有机酸、多羟基酸、糖、磷酸盐、多元醇和氮化合物。其中，高含量的酚酸（如邻苯二甲酸、水杨酸）和脂肪酸（如棕榈酸、肉豆蔻酸和油酸）可以招募更多保护寄主植物的益生菌。本研究中我们发现，Hyphomicrobium（一种典型的反硝化细菌）、Nitrospirae和固氮细菌的丰度与红树林表层和根际大量的根系分泌物呈正相关；这些微生物的存在可能会导致红树林生态系统中氮的快速循环。

确定性和随机性组装沿着演替的时间序列同时发生，并驱动着许多生态系统中微生物群落的空间分布，但与根系相关的微生物群落的组装和选择偏好仍然存在争议。首先，根际微生物群落的相对丰度模式遵循一定的空间变化规律。水稻和拟南芥微生物群的相似模式表明，endosphere中Proteobacteria和Spirochetes的比例高于根际或非根际土壤，而其中的Acidobacteria和Chloroflexi大多被消耗殆尽。在本研究中，我们的结果还表明，Proteobacteria的丰度从非根际土壤到endosphere土壤逐渐增加，而Chloroflexi的丰度则表现出相反的趋势。具体地说，我们发现，相比于其他三个土壤区域，Desulfococcus，Desulfosarcina以及Defluviitalea等SRB主要在endosphere区域内被消耗，这表明红树植物根际的微生物群落相对丰度在endosphere和非根际之间存在着一定的规律性。

其次，红树林根系微环境的特定生境特征可能对其微生物群落聚集有重要影响。在以前的研究中，水的连通性被视为是在大多数生态系统中构建微生物群落的主要因素，随机因素在水环境组合中占主导地位。相反，一些与宿主相关的细菌群落，包括动物肠道微生物，被视为具有比随机过程更高比例的确定性过程。在本研究中，我们发现在4个红树根区中，确定性过程占主导地位，这表明红树根部的微生物定殖不是一个被动的过程，红树植物对其伴生群落具有很强的选择性。

第三，许多研究表明，根微生物群的获取是一个连续的逐步过滤过程。在本研究中，许多优势微生物门（如Proteobacteria、Spirochetes、Firmicutes、Acidobacteria和Actinobacteria）在episphere土壤中有一定程度的富集，而特定的门（如Proteobacteria，Spirochetes以及Acidobacteria）在endosphere土壤中有选择性的富集。这些结果表明，红树根部微生物群落的组合格局可能取决于扩增-选择模式。据我们所知，目前在红树林生态系统中还没有将组装过程与具有空间模式的时间序列结合起来的相关研究，进一步探讨影响这种组装过程的因素和潜在的机制具有十分重要的意义。

本研究中，我们探究了红树林根系对与根相关的微生物群落的多样性、功能和聚集度的空间和渗出效应。在红树林根系环境中，与根相关的微生物群落可以形成四个空间上可分离的隔室，并表现出不同的多样性和功能格局。此外，我们还发现，根系分泌物对episphere土壤和根际土壤的根际微生物菌群发育起着重要的作用。此外，每个红树根区都有其细菌和真菌群落的独特生态位。组装机制似乎由扩增-选择模型来表示。本研究为理解红树林根部环境中微生物的多样性、功能及其组装机制提供了新的见解。进一步的研究需要阐明根系分泌物影响根系微生物菌群的机制，并探索红树林生态系统中微生物-土壤-植物的相互作用。

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