原名：Fusobacterium nucleatum Secretes Outer Membrane Vesicles and Promotes Intestinal Inflammation

译名：具核梭杆菌Fusobacterium nucleatum分泌外膜囊泡并促进肠道炎症

期刊：mBio

IF：6.784

发表时间：2021.3.2

通讯作者：James Versalovic

通讯作者单位：美国德克萨斯州休斯顿贝勒医学院病理学和免疫学系

1）定殖定位实验：用荧光标记的F. nucleatum验证该致病菌能否促进上皮促炎症反应并可能导致肠道炎症的假说。

2）细胞体系-体外实验：假设F. nucleatum分泌的毒力因子，例如OMV，可能会将促进上皮细胞的促炎作用。为了检验该假设，培养F. nucleatumsubsp. polymorphum，然后将上清液按大小小于或大于50 kDa分馏。将大小分级的细菌培养用于HT29细胞单层，并测量IL-8的产生，以确定该菌分泌的因子是否刺激了促炎性免疫反应。

3）动物实验验证：根据体外实验结果，推测该菌产生的毒力因子也会在体内实验时可能会有类似的作用，所以进行了灌胃-定殖实验，对整体健康没有致命的有害影响。

1 F. nucleatum subspecies polymorphum附着在肠粘液上并分泌OMV

几项研究已确定口腔细菌Fusobacterium 存在于结直肠癌，肝硬化（原发性硬化性胆管炎，胃食管反流病，HIV感染，酒精中毒和IBD。鉴于粘膜标本中的F. nucleatum 普遍存在，我们测试了这种病原体可以促进上皮促炎反应并可能促进肠道炎症的假说。使用荧光标记的F. nucleatum subsp.polymorphum ATCC 10953，我们发现F. nucleatum驻留在与人类结肠T84细胞相邻的粘液层中的聚集体中（图1A）。为了确认与粘液层的结合，我们还检查了F. nucleatum 对涂有来自T84细胞的纯化MUC2的盖玻片的粘附力，并观察到了牢固的粘附力（图1B）。肠道粘液层的定殖使微生物（例如F. nucleatum）在上皮细胞附近分泌宿主调节性亚细胞结构或化合物。一种可能影响宿主的潜在亚细胞结构是OMV。先前的研究表明，F. nucleatum subsp. nucleatum 和 F. nucleatumsubsp. animalis可以分泌OMV。与这些发现一致，我们观察到了F. nucleatum subsp. polymorphum。NanoSight测定结果表明，F. nucleatum subsp.polymorphum 分泌了一系列OMV，平均流体力学直径为212±7 nm（图1C和D）。

图1 F.nucleatum subsp. polymorphum 粘附在结肠MUC2上并分泌OMV。（A）与荧光标记的F. nucleatum subsp.polymorphum 培养后T84细胞的代表性图像用核染料Hoechst（比例尺，50 μm）复染色的吗啡。（B）荧光标记的F. nucleatum subsp. polymorphum 的代表性图像F. nucleatum subsp. polymorphum 附着在纯化的MUC2（比例尺，50 μm）上。（C）附有OMV并围绕细菌的F. nucleatum（横截面）的TEM图像。右侧的图像描绘了OMV的各种尺寸（比例尺，200 nm）。（D）F. nucleatum subsp. polymorphum OMV的纳米颗粒跟踪分析。

2 F. nucleatum subspecies polymorphum分泌的化合物和纯化的OMV促进结肠促炎细胞因子的分泌结果

来自其他革兰氏阴性物种的OMV可以激活先天性免疫反应，例如TLR，可以激活NF-κB途径并驱动促炎性细胞因子反应。我们假设F. nucleatum分泌的毒力因子，例如OMV，将促进上皮细胞的促炎作用。为了检验该假设，我们培养了F. nucleatumsubsp. polymorphum。在BHIS（补充的脑心脏输注介质）中将F. nucleatum subsp. polymorphum上清48小时，然后将上清液按大小分馏至小于或大于50 kDa。将大小分级的条件培养基应用于HT29细胞单层，并测量IL-8的产生，以确定F. nucleatum的分泌因子是否刺激了促炎性免疫反应。小于50 kDa（<50 kDa）的条件培养基部分的表现与阴性对照（BHIS）相似，并且对HT29细胞的IL-8产生没有影响（图2A）。然而，与单独的培养基相比，添加大于50 kDa（> 50 kDa）的条件培养基级分（包含OMV）的2.4 μm以上的颗粒刺激了IL-8分泌约9倍的增加。向HT29细胞单层中添加纯化的F. nucleatumOMVs也会刺激IL-8的产生，这表明条件培养基中> 50 kDa部分中的活性分泌因子包括OMV。用TLR4抑制剂CLI-095预处理HT29细胞1小时，可显著减弱响应于> 50-kDa的F. nucleatum条件培养基和OMV的IL-8分泌。该结果表明TLR4激活导致F. nucleatum subsp. polymorphum刺激IL-8产生TNF分泌也观察到类似的模式（图2B）;与未接种的BHIS对照和<50-kDa的F. nucleatum条件培养基相比， F.nucleatum纯化的>50-kDa的OMVs刺激TNF分泌增加约6倍（图2B）。

图2 F. nucleatum化合物和OMV促进IL-8，TNF，NF-κB和MAPK活化。（A）与25％未接种BHIS（BHIS），25％Fusobacterium nucleatum BHIS条件培养基<50-kDa馏分（<50 kDa）（<50 kDa）培养16 h后，通过ELISA在HT29细胞上清液中通过ELISA测定IL-8（pg/ml）），在不存在或存在TLR4抑制剂CLI-095的情况下在DMEM中使用25％的F. nucleatum BHIS条件培养基> 50-kDa馏分（> 50 kDa）或5％的纯化的F. nucleatum OMV（OMV）（n = 6重复）/实验，重复三个独立的时间）。（B）用25％未接种BHIS（BHIS），25％F. nucleatum BHIS条件培养基<50-kDa分数，25％F. nucleatum BHIS条件培养16 h后，通过ELISA在HT29上清液中通过ELISA测定HT29上清液中的TNF（pg / ml）在不存在或存在TLR4抑制剂CLI-095的情况下，在DMEM中加入浓度大于50 kDa的中等培养基或5％纯化的F. nucleatum OMVs（OMVs）（n = 6次重复/实验，重复3次独立的时间）。（C）定量处理了16 h的pNFκB-MetLuc2-Reporter转染的HT29细胞中荧光素酶的分泌（n = 9/实验，重复两次独立的时间）。（D）在HT29细胞中培养30分钟时，磷酸化ERK，磷酸化CREB，磷酸化iκB，总iκB和肌动蛋白的蛋白质印迹分析（n = 3/实验）。处理方法与图A，B和C相同。使用Fiji软件对Western印迹进行定量。（E）通过刃天青素分析（激发，560；发射，600 nm）分析HT29细胞中的代谢活性/生存力。*P＜0.05（multi-way ANNOVA）。

NF-κB对于包括IL-8在内的促炎细胞因子的上调是必不可少的。为评估F. nucleatum分泌因子是否激活了NF-κB，我们用pNFκB-MetLuc2-Reporter转染了HT29单层，以监测NF-κB信号转导途径的激活。F. nucleatum条件培养基和纯化的OMV，分泌的荧光素酶显著增加（表明NF-κB活化）。（图2C）。将TLR4抑制剂与HT29细胞一起培养会使NF-κB荧光素酶的产量降低约2倍。接下来，我们将HT29细胞与分级条件培养基或纯化的OMV培养30分钟后，通过蛋白质印迹检查了其他下游靶点TLR4，ERK和CREB（图2D）。如预期的那样，培养基对照和<50 kDa F. nucleatum培养物在30分钟的时间点未激活p-ERK，p-CREB或p-iκB。但是，与培养基对照相比，添加> 50-kDa的F. nucleatum条件培养基和纯化的OMV会增加p-ERK，p-CREB和p-iκB的含量。重要的是，我们没有观察到细胞活力/新陈代谢的降低。实际上，我们观察到刃天青素向角叉蛋白的转化率略有增加，这表明响应于F. nucleatum条件培养基的细胞代谢增加（图2E）。这些数据证明了结肠上皮细胞对由F. nucleatumsubsp. polymorphum分泌的因子的强烈反应。尽管HT29结肠癌衍生的细胞可以模拟一些肠上皮功能，但它们并不能整体反映出肠上皮的情况。人肠小肠（HIE；也称为类器官）系统扩大了我们在体外了解非癌性人肠上皮生理的能力。HIE源自肠道干细胞，并提供长期的原代培养系统。重要的是，HIE包含天然组织中发现的所有细胞谱系，具有节段特异性，并包含TLR。先前我们已经表明，HIE培养基包含许多抗氧化剂，包括N-乙酰半胱氨酸，谷胱甘肽，B27补充剂和N2补充剂，可抑制促炎性信号传导级联反应。但是，通过使用不含抗氧化剂的简化培养基，可以产生对微生物刺激有反应的HIE，例如脂多糖（LPS），脂蛋白酸和鞭毛蛋白。我们使用从健康成年人中分离出的结肠上皮干细胞衍生的HIE，检查了F. nucleatum分泌的化合物对未发炎的肠上皮的影响。光学显微镜观察表明，用大于50 kDa的F. nucleatum条件培养基处理结肠HIE单层不会影响细胞形态（图3A）。与培养基对照相比，用大于50 kDa的F. nucleatum培养液处理可促进结肠HIE单层的TNF分泌（图3B）。与我们的HT29模型相反，我们发现培养基对照和条件条件下的F. nucleatum条件培养基之间IL-8分泌没有差异（数据未显示）。用pNFκB-MetLuc2-Reporter转染结肠HIE单层细胞，证实了用Fusobacterium nucleatum培养液处理后NF-κB的上调（图3C）。Luminex Magpix对HIE细胞裂解物的分析显示，用大于50 kDa的F. nucleatum条件培养基处理后，p-ERK和p-CREB增加，与我们的HT29细胞数据一致。这些数据证实了我们的HT29细胞数据，并证明了由F. nucleatum产生的>50-kDa化合物可以刺激上皮炎性信号。

图3 大于50-kDa的F. nucleatum化合物在人类结肠单层中促进TNF，NF-κB和MAPK信号传导。（A）用25％BHIS（BHIS）或25％F. nucleatum条件培养基在DMEM，1×HEPES，1×GlutaMAX和丙酮酸中处理> 50-kDa分数（> 50 kDa）的人结肠样单层的代表性图像h（比例尺，100 μm）。（B）培养16×h后，用ELISA测定用25％BHIS（BHIS）或25％F. nucleatum B.Scles BHIS条件培养基处理的结肠样单层中TNF（pg / ml）> 50-kDa分数（n = 4单层/实验，重复两个独立的时间）。（C）定量处理了16 h的pNFκB-MetLuc2-Reporter转染的人结肠单层细胞中分泌的荧光素酶的数量（n = 4单层/实验）。（D和E）用25％BHIS（BHIS）或25％F. nucleatum条件培养基> 50-kDa分数处理1Dah（n）的人结肠样单层中的磷酸化ERK（D）和CREB（E）的Luminex Magpix多重分析= 3个单层/实验）。*P＜0.05（t检验）。

3 服用抗生素后，F. nucleatum subsp.polymorphum会促进人源化小鼠模型中的炎症

根据体外数据，我们接下来使用小鼠模型探究F. nucleatum是否可以引发促炎反应（图4）。由于镰刀菌属，常见于人类的胃肠道中，而不是小鼠，并且可能与人类来源的微生物发生独特的相互作用，我们使用定居了人源肠道菌群的小鼠，也称为人源化菌群小鼠。用单剂量的F. nucleatum（10⁹ CFU）灌胃小鼠，并在接种F. nucleatum后第3天和第5天安乐死。接种后第3天或第5天，从F. nucleatum治疗的小鼠的隐窝结构或肠道上皮的免疫浸润均未观察到变化（图4A）。同样，尽管通过定量PCR（qPCR）分析在粪便中发现了低水平的梭状芽胞杆菌gDNA（表1），但FISH并未在结肠粘液层中鉴定出F. nucleatum（图4B）。仔细检查结肠基因表达，发现KC（小鼠与IL-8的同源物），IL-6，IFN-γ和F. nucleatum趋化蛋白1（MCP-1）的促炎细胞因子基因表达没有变化。当存在完整的肠道菌群时，在第3或5天用F. nucleatum处理的小鼠（图4D和E）。这些发现表明，在完整的人类菌群环境中，F. nucleatum对整体健康参数没有有害影响。

图4 F.nucleatum subsp. polymorphum在完整的肠道微生物组存在下，无法促进炎症。（A）对照动物和F. nucleatum subsp. polymorphum的H＆E染色的代表性图像。感染后第3天和第5天用F. nucleatum subsp.polymorphum体治疗的动物（比例尺，100 μm）。（B）感染后第3天和第5天用MUC2（黄色）和Hoechst（蓝色）复染的梭菌（红色）的FISH染色（比例尺，100 μm）。（C）在感染后第1、2、3和5天的小鼠体重分析（n = 6 /组）。*P＜0.05（重复测量方差分析）。（D）在感染后第3天（n＝6/组）促炎相关基因的结肠mRNA表达。*P＜0.05（双向方差分析）。（E）在感染后第5天（n＝6/组）促炎相关基因的结肠mRNA表达。*P＜0.05（双向方差分析）。

表1 基于F. nucleatum subsp. polymorphum 标准培养物计算的梭状芽孢杆菌粪便负荷

我们以前在使用抗生素的患者粪便样本中检测到的Fusobacterium操作分类单元（OTU）丰度增加。结果，我们认为F. nucleatum可能需要一个可用的利基来促进肠道炎症。为了解决这个问题，用抗生素混合物（卡那霉素，庆大霉素，粘菌素，甲硝唑和万古霉素）对人源化微生物群小鼠进行治疗5天，然后单次注射克林霉素。先前已显示这种广谱抗生素治疗方案可通过16S rRNA测序减少多种细菌OTU。抗生素治疗后，立即向小鼠口服F. nucleatum（109 CFU）。设计该治疗方案以改变微生物组并为F. nucleatum提供潜在的利基市场。在接种F. nucleatum后第3天安乐死的小鼠的肠道上皮表现出结肠结构破坏，免疫浸润增加和粘液层耗尽，导致腔内物质更靠近肠道上皮（图5A）。接种F. nucleatum后5天，与第3天相比，小鼠结肠上皮细胞显示出减少的结构破坏和免疫浸润，但仍显示出杯状细胞损失和较薄的粘液层。荧光原位杂交（FISH）证实了在第3天和第5天上皮粘液层中均存在F. nucleatum，在第3天观察到了最多的细菌（图5B和表1）。与磷酸盐缓冲液（PBS）处理的小鼠相比，用F. nucleatum镰刀进行口腔管饲也与体重减轻有关，这支持了F. nucleatum镰刀对健康有负面影响的观点（图5C）。结肠基因表达的分析显示，经核糖核酸处理的上皮细胞和免疫细胞分泌的KC（小鼠IL-8同源物）和免疫细胞分泌的IL-6，IFN-γ和MCP-1的浓度增加与第3天的PBS治疗相比（图5D）。IL-6在接种F. nucleatum后第3天表现出最大的表达增加变化。除TNF外，与第3天观察到的相比，第5天的F. nucleatum组的细胞因子基因表达明显较低（图5E）。但是，与用PBS对照处理的小鼠相比，在F. nucleatum处理的小鼠中KC，TNF，IL-6，IFN-γ和MCP-1仍然增加。这些数据表明，在存在破坏抗生素的人源化菌群的情况下，F. nucleatum能够在体内驱动促炎性信号传导级联反应。总的来说，这些发现扩大了我们对F. nucleatum-宿主相互作用的认识，并表明口服衍生的F. nucleatum可以刺激炎症反应。

图5 F.nucleatum subsp. polymorphum通过肠道微生物组的抗生素破坏来驱动体内炎症。（A）对照动物和F. nucleatum subsp. polymorphum的H＆E染色的代表性图像。在感染后第3天和第5天接受抗生素治疗的F. nucleatum subsp. animalis（比例尺，100 μm）。蓝色箭头突出显示免疫浸润。（B）在感染后第3天和第5天，用MUC2（黄色）和Hoechst（蓝色）复染的梭菌（红色）的FISH染色。放大的插图显示了在第3天和第5天的梭状芽孢杆菌（比例尺，100 μm）。（C）在感染后第1、2、3和5天的小鼠体重分析（n = 6/组）。*P＜0.05（重复测量方差分析）。（D）在感染后第3天（n＝6/组）促炎相关基因的结肠mRNA表达。*P＜0.05（双向方差分析）。（E）在感染后第5天（n＝6 /组）促炎相关基因的结肠mRNA表达。*P＜0.05（双向方差分析）。

对F. nucleatum如何促进炎症的更深入了解可能潜在地促进用于治疗多种肠道疾病的新颖治疗方法的发展。我们的数据表明， F. nucleatum subsp. polymorphum 分泌OMV，可以激活TLR4和下游靶点ERK，CREB和NF-κB，从而促进促炎性细胞因子的产生。在结肠HT29细胞以及人结肠样（有机体）单层中观察到了这些作用。这些体外数据支持以下假设：F. nucleatum能够通过分泌化合物的产生引发肠道炎症。在存在人类微生物组的小鼠中，我们发现抗生素治疗使F. nucleatum附着在肠粘液层上并驱动炎症，如体重减轻，免疫渗透增加，结肠结构改变和促炎细胞因子mRNA信号所示。我们还发现，抗生素介导的肠道微生物组耗竭对于F. nucleatum介导的作用至关重要。这些数据提供了有力的证据，证明当有开放的利基空间时，F. nucleatum可以促进胃肠道的炎症。

关于F. nucleatum的大多数研究都集中在其作为牙周病原体的作用上。但是，近年来，研究人员也开始将F. nucleatum也视为肠道病原体。这在很大程度上是由于在IBD和大肠癌患者的结肠活检标本中鉴定了F. nucleatum。许多革兰氏阴性细菌，包括F. nucleatum，都会在体内和体外释放OMV，这些纳米颗粒被认为是细菌发病的主要因素。OMV通常包含LPS，DNA，粘附素和酶，因此已被提议充当这些毒力因子的传递系统。我们的体外研究表明，包括OMV在内的F. nucleatum条件培养基对TLR4的激活在上皮细胞因子的产生中起着重要作用。结果，我们推测外膜LPS可能正在驱动这种效应。与此假设相符，我们观察到从F. nucleatum subsp. polymorphum 纯化的LPS的应用。F. nucleatum subsp. polymorphum 还刺激了我们的HT29细胞中的IL-8（数据未显示）。但是，我们不认为TLR4是F. nucleatum分泌的化合物和OMV所采用的唯一途径。在结肠癌研究中，发现促炎性细胞因子对F. nucleatum的刺激是通过TLR4依赖性和非依赖性机制发生的。帕克（Park）等人。证实F. nucleatum激活了骨髓来源的巨噬细胞中的TLR2和TLR4来刺激IL-6的产生，这种作用在没有MyD88的情况下被完全消除了。因此，很可能其他TLR可能会响应于F. nucleatum分泌的产物而被激活。结果，我们推测OMV通过体内TLR4依赖性和非依赖性机制激活上皮细胞和免疫细胞。我们推测，与癌症模型相似，与F. nucleatum相关的炎症很可能取决于MyD88信号传导。除LPS外，Fusobacterium nucleatum OMV中还有许多具有潜在毒力功能的蛋白质。这些蛋白质包括FomA，FadA，FadD，Fad-1，NapA，ClpB，GroEL，TraT和YadA。还需要对它们对疾病的贡献进行进一步研究。除OMV外，F. nucleatum还可能分泌其他刺激TLR并驱动炎症的化合物。尽管我们的体外研究表明OMV会引起炎症，但我们的>50 kDa组分也可能含有其他能够刺激细胞因子的大分子化合物。另外，大分子化合物可能与OMV协同作用以驱动炎症。我们的体内研究并未排除其他炎症机制。有必要进行进一步的研究，以解决其他因素在刺激炎症信号中的作用。

除分泌因子外，多项研究还发现，F. nucleatum能够侵入上皮细胞，并且可以直接激活促炎信号。口腔上皮细胞的F. nucleatum侵染会激活NF-κB并诱导促炎性细胞因子（IL-8，TNF，IL-1β和IL-6）。在患癌症的情况下，癌细胞对F. nucleatum的入侵也诱导了NF-κB和促炎性细胞因子的产生。尽管我们在研究中观察到了细胞因子的产生和炎症，但是通过FISH染色我们几乎看不到F. nucleatum上皮侵袭的证据。我们发现，F. nucleatum可以粘附到结肠粘蛋白聚糖上，并预测粘液粘附可能会限制F. nucleatum侵入上皮细胞。缺乏侵袭的另一种可能的解释可能是由我们的小鼠模型中完整的上皮引起的。F. nucleatum可能需要破坏或上皮脆性才能侵入结肠上皮。此外，我们的发现可能与菌株有关，因为从IBD患者中分离出的临床分离株的特征是比从健康受试者中分离出的F. nucleatum更易发炎。例如，从肠道发炎区域分离出的F. nucleatum显示出对Caco-2细胞的侵袭增强并触发了TNF。这些结果表明，尽管总的来说F. nucleatum可能是促炎的，但某些菌株比其他菌株更具致病性。

我们的数据表明，F. nucleatum需要破坏微生物组以促进炎症。Collins等人的先前工作，使用相同的人源化小鼠模型表明，与不使用抗生素的小鼠相比，使用抗生素治疗可显著降低Lachnospiraceae，Bacteroidaceaceae，Clostridiaceae和Verrucomicrobiaceae的水平。这些发现似乎与溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）的IBD患者肠道菌群中的微生物组成相似，而与健康志愿者或非IBD对照相比，观察到了鞭毛藻科和拟杆菌属的减少。另外，结直肠癌患者的肠道菌群通常在鞭毛藻科，拟杆菌属和梭状芽胞杆菌中消耗，并富集了梭菌。一项研究发现，唇形藻科的高丰度与口腔微生物（Fusobacterium ，链球菌，双歧杆菌等）对结肠组织的定植负相关。这些微生物组研究表明，对于某些肠道微生物（如Lachnospiraceae和共生的拟杆菌属），它们具有保护性的定植抗性作用。我们认为，Lachnospiraceae，拟杆菌属和其他消耗抗生素的微生物可能会阻止F. nucleatum定居并因此阻止炎症。

肠道微生物组具有弹性，经过抗生素治疗后可以恢复到原来的种群。与此概念相一致，Collins等在相同的人类微生物组小鼠模型中观察到抗生素后微生物组的分辨率，并预测微生物群落最终将返回基线。结果，我们推测F. nucleatum subsp. polymorphum不会在我们的抗生素治疗的小鼠模型中持续存在。我们预测随着微生物组的恢复，F. nucleatum将竞争激烈，并且炎症会消退。到灌胃后第5天，与第3天相比，在抗生素治疗的小鼠中，通过FISH染色观察到的F. nucleatum较少，炎性标志物更低。我们预测F. nucleatum的作用仅能保留几天，因为微生物组恢复了其通常的复杂性。为了完全解决这个问题，需要进行更多的研究来确定抗生素施用后F. nucleatum和微生物组的精确平衡。

Fusobacterium通常见于混合微生物感染中。这部分是由于F. nucleatum的共同性质。它带有多种粘附素，可促进多种生物膜的形成。这些微生物-微生物相互作用已在口腔中得到了充分证明。然而，生物膜的形成也可能是肠道F. nucleatum定殖在肠道中的潜在策略。抗生素作用后存在的微生物可能与F. nucleatum相互作用并促进其持久性。由于口腔微生物通常在肠道疾病状态中发现，并且已知F. nucleatum会与多种口腔细菌聚集并形成生物膜，因此这些人群之间可能存在协同作用，以促进肠道炎症和病理。Ledder等人证明F. nucleatum 可与肠道微生物共聚，包括青春双歧杆菌和副干酪乳杆菌，而与小杆菌，粪肠球菌可共聚。因此，F. nucleatum可能与粘膜相关的肠道微生物相互作用，以增强定植。总的来说，我们的发现表明，F. nucleatum可以在体外和体内促进正常上皮细胞的炎症（图6）。我们推测遗传易感患者中的某些F. nucleatum菌株可能是炎症的起因或促成因素。我们预测，在接受抗生素治疗的患者中，微生物组不会提供定植抗性，并且F. nucleatum可以定殖。我们还认为，异常的免疫反应加上改变的微生物组和F. nucleatum可能导致慢性炎症。我们的研究结果表明，F. nucleatum和OMV是肠道炎症的驱动因素，因此有待进一步研究，以作为旨在减少粘膜炎症的治疗策略的未来目标。

图6 F.nucleatum subsp. polymorphum引起的炎症拟议模型。在改变的肠道微生物组的情况下，F. nucleatum黏附在肠粘液层，在肠黏液层中，其将分泌的化合物作为“货物”传递到OMV中。OMV激活包括TLR4在内的上皮TLR，TLR4促进ERK，CREB和NF-κB的磷酸化和激活，从而驱动促炎性细胞因子的产生并引发炎症。