1 土壤化学性质

随着自上而下和自下而上因素的增加，土壤化学性质随时间发生了显著变化。图1总结了对有机肥、化学以及时间的影响的结果。土壤氧化还原电位（Eh）随时间显著降低，而土壤pH显著升高（图1A和B）。在三周内，土壤总碳，碳氮比和有效磷也发生了变化（图1C、E和F）。TC、C/N比、有效磷和Na含量受自下而上因素的显著影响（图1C、E，F和H）。在自下而上的因素中，只有CF对土壤的pH和Eh有显著影响（图1A–B），只有OF对TN和可交换K有显著影响（图1D和G）。生物体的自上而下的作用显著改变了土壤的pH值，有效磷和可交换钾的含量（图1B，F和G）。

图1 自上而下和自下而上的因素以及时间对土壤理化性质的影响。P，原生生物（黑条）；OF，有机肥（深灰色条）；CF，化肥（浅灰色条）；培养天数（白条）。

2 自上而下和自下而上对细菌多样性和群落组成的影响

总共获得3071605条序列，经质量过滤并去除了嵌合体、singleton和doubleton序列，得到2221347条序列，每个样本平均29667条序列。细菌丰富度和多样性指数如图2所示。细菌的多样性随培养时间的增加显著增加。自上而下和自下而上的因素对观察到的OTU数目和Shannon指数均无显著影响（图2A–B）。系统发育多样性指数在原生生物中显著增加，而CF和OF处理则无显著差异（图2C）。

图2 自上而下和自下而上的因素以及时间对OTU数目（A），Shannon指数（B）和Faith’s PD（C）的影响。P，原生生物（黑条）；OF，有机肥（深灰色条）；CF，化肥（浅灰色条）；培养天数（白条）。

细菌的β多样性随时间的推移而变化，这取决于存在自上而下和自下而上的因素（图3），其中原生生物自上而下的影响大于肥料自下而上的影响（表2）。在自下而上的因素中，OF对细菌β多样性有显著影响，而CF的影响不显著。细菌β多样性随时间发生显著变化。尽管CF对细菌β多样性没有显著影响，但CF与原生生物的相互作用具有显著影响（表2）。时间、原生生物、CF和OF在第二、第三和第四阶段之间的其他交互作用没有显著影响。原生生物的存在与细菌群落β多样性的变化显著相关，并且NMDS分析根据原生生物的存在与否将细菌群落分为两组（图3）。细菌群落也根据采样时间进行分组：第21天的细菌群落与第3天和第7天的细菌群落分开。细菌群落组成的变化与土壤养分不相关。但是，土壤pH的升高和土壤氧化还原电位（Eh）的降低与细菌群落组成的变化显著相关。

图3 基于细菌群落的Bray-Curtis相异指数计算的NMDS图，群落组成与土壤理化性质之间存在显著相关性。红色，没有原生生物。绿色，有原生生物。圈，第3天；三角形，第7天；正方形，第21天。箭头指示细菌群落与环境参数之间的显著相关性。

表2 使用多元方差分析（PERMANOVA）基于Bray-Curtis相异指数分析不同处理对细菌群落组成构成的自上而下和自下而上影响的差异结果。

表注：采样时间（第3天、第7天和第21天）；CF，化肥；OF，有机肥料；SC，显著性标注（***，P < 0.001；**，P < 0.01；*，P < 0.05）。

LEfSe分析说明了自上而下和自下而上对细菌群落的影响的差异，揭示了不同处理中多种生物分类水平的细菌群落的指示微生物（图4）。与CF和OF的自下而上的作用相比，原生生物的自上而下的作用产生了更多的指示微生物（图3D）。与自上而下的因素相关的指示物种的数量分别比与CF和OF相关的指示物种的数量分别高4.4和3.7倍。在存在和不存在原生生物的情况下，指示微生物主要属于变形杆菌和拟杆菌（图4D）。CF和OF的自下而上的效果显示了相似的结果（图4D），其中拟杆菌、变形杆菌和厚壁菌受到了影响。

图4 线性判别分析效果大小（LEfSe）方法通过比较存在和不存在原生生物的细菌群落，在多个分类学水平上鉴定出指示解释细菌群落间最大差异的分类群。彩色圆点代表各处理之间的丰度明显不同的指示微生物。直方图显示了细菌中显著差异的LDA大小。

3 自上而下和自下而上的处理中特有的OTU

维恩图显示了细菌群落的自上而下和自下而上的因素（图5）。为了揭示原生生物对细菌群落组成的自上而下的影响，作者比较了从原生生物接种和未接种的处理中获得的OTU的通用性和独特性（图5A）。结果表明，有58.4％的OTU是常见的，分别有24.8％和16.8％的OTU专门针对原生和非原生处理（图5A）。在没有和存在原生生物的情况下，特有的OTU在门水平上显示出相似性。主要是变形菌门，其在存在和不存在原生生物的处理下分别为64％和49％，其次是拟杆菌，其在存在和不存在原生生物的情况下分别为26％和31％。自下而上的因素的存在显示出相似的结果（图5B和C）。

图5 维恩图说明在没有和存在原生生物（A）、化学肥料（B）和有机肥料（C）的情况下，在属水平上特有和共享的细菌OTU的数量和百分比。

数十年来，自上而下和自下而上的因素对细菌群落的贡献一直是一个热门话题。最近对海洋生态系统的研究已经认识到自上而下的因素无可辩驳的影响，并挑战了传统的观点，即细菌群落主要被自下而上的因素影响。在淡水生态系统中已经获得了相反的结果，其中自下而上的因素对细菌群落的影响要强于自上而下的因素。作者的研究首次直接比较了自上而下和自下而上对土壤生态系统细菌群落组成的影响，该研究表明，无论是否施用自下而上的肥料，自上而下的捕食者都可以有效地控制细菌的群落结构。在这项研究中，作者使用高压灭菌的土壤来研究存在和不存在生物的情况下的细菌群落。土壤的热灭菌处理丰富了可用的养分，在这种情况下，与未灭菌的土壤相比，施肥的自下而上效应可能被低估了。另一方面，在营养丰富的条件下，捕食者的自上向下效应也受到限制。然而，作者的结果表明了原生生物对于调节稻田土壤中细菌群落形成的重要性。

1 自上而下对细菌群落组成的影响

在这项研究中，原生生物对细菌群落组成的自上而下的影响是明显的，并且大于化肥的自下而上的影响，这与作者的假设一致。土壤含水量是影响原生生物活动的关键因素之一。尽管大多数实验是使用单一的原生生物分离株进行的，但长期以来原生生物对细菌群落组成的存在巨大的影响。与单一分离株相比，原生生物的混合培养物会以各种各样的细菌为食，导致细菌群落的急剧变化。作者以前的研究表明，四种原生质分离株的混合物对水田细菌群落组成的影响要大于单一分离株的影响。在这项研究中，使用四种在分类学、进食模式、细胞大小和形态上不同的原生质分离株，可以通过影响多种细菌分类群来更好地反映这种作用。作者假设，在真正的稻田环境中，原生生物高度占主导地位且种类繁多，这些细菌天敌可能具有更重要的自上而下的作用来控制细菌的形成。此外，在自然条件下，原生生物的密度可能会高于当前研究中最初接种的密度，这是影响原生生物对细菌影响的另一个重要因素。关于原生生物-细菌相互作用的进一步研究可能会更好地了解稻田中细菌群落的动态。

原生生物对细菌群落的自上而下的影响通常可以通过变形杆菌和拟杆菌的变化来解释，这与作者目前的结果是一致的。研究表明，属于变形杆菌的细菌种类，尤其是革兰氏阴性菌是原生生物的首选猎物。但是，许多革兰氏阴性菌可以通过多种机制幸存于原生生物捕食中，包括细胞内对消化的抗性、高运动性以及生物膜生产。此外，变形杆菌和拟杆菌包括许多具有快速生长能力的细菌，这使它们能够替代因捕食而丢失的细菌，这解释了两个门系中的波动取决于原生生物的存在与否。

对细菌的原生生物捕食行为通常会增加土壤肥力和植物生长，这与提高养分周转率和细菌活性有关。以前，作者证明了原生生物的存在提高了水稻根际中促进植物生长细菌（PGPR）的丰度。考虑到许多PGPR物种都属于变形杆菌和拟杆菌，因此在稻田中，受原生生物调节的细菌群落形成可能与土壤肥力有关。

2 化肥对细菌群落组成的自下而上效应

研究以田间施用量施用有机肥和化肥的效果，以评估自下而上的效果，所以本研究忽略了原始土壤养分的潜在自下而上效应。结果表明，CF的施加对细菌群落组成没有明显的自下而上的影响。化学肥料对土壤细菌群落的影响通常与施用的氮相关。在这项研究中，由于初始土壤中的氮含量很高，因此CF对总氮含量没有显著影响。和OF因此，作者没有观察到肥料对细菌群落的任何基于氮的作用。OF对细菌的α和β多样性具有重大影响。此前，Daquiado等人获得了相似的结果，未施肥和化学施肥的水稻土细菌群落相似，而有机肥的施用导致细菌群落发生变化。与未施肥的稻田相比，长期施用化肥对稻田的细菌群落影响很小。

CF和OF特异的OTU主要属于拟杆菌，这与之前在稻田土壤中的研究相一致。因此，它们有望对自下而上的丰富营养产生良好的反应。尽管在门分类水平对细菌的自下而上的作用相似，但作者的结果表明，CF和OF的施用导致细菌群落略有不同，这表明自下而上作用的来源很重要。OF的施加显著提高了总碳含量。因此，在这项研究中，对细菌的α和β多样性的明显的自下而上的影响很可能是基于有机碳的。

在土壤环境中，肥料也对自上而下的放牧者产生深远的影响。肥料对包括原生生物在内的微真核生物群落的长期影响要强于稻田中水分管理或季节性变化的影响。实际上，肥料对原生生物群落的影响大于对细菌群落的影响。以前，作者证明了生物碳肥料的施用对原生生物和细菌之间的相互作用产生了负面影响。因此，在这项研究中没有考虑到施肥对原生生物的自下而上的影响，这可能会使细菌对捕食者群落的反应增加另一层复杂性。此外，在这项研究中，作者仅使用了四种原生生物。由于自然条件下土壤原生生物的多样性要高得多，而植物、原生生物和细菌之间的相互作用则要复杂得多，因此在实际研究中将重点放在自上而下和自下而上的因素上。

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