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Clinically relevant mutations in core metabolic genes confer antibiotic resistance

作者：Allison J. Lopatkin等

期刊：Science

时间：2019.2.15

影响因子：41.845

DOI： 10.1126/science.aba0862

高通量测序方法：使用Illumina HiSeq 2500 进行基因组测序

主要的研究方法：

使用3种抗生素[streptomycin (strep), ciprofloxacin (Cipro), and carbenicillin (carb)]对大肠杆菌BW25113菌株进行经典的进化选择（选取最后抗生素浓度最高时存活下的菌株，进行基因组测序，接着进行large indels、SNPs、KEGG代谢功能进行分析），然后使用行代谢依赖的方法进行抗生素进化选择，接着进行基因遗传分析，最后使用基因敲出的方法进行验证。

主要的结果：

1 Identifying genetic changes associated with antibiotic resistance

经Cipro处理的克隆中，92%的克隆在药物靶点（由gyrA或gyrB编码）有突变，100%的克隆在rob中获得突变，rob编码一种已知的多药耐药和应激的全球转录调节因子回应。两个克隆（16.7%）在icd中有突变，icd编码一种核心代谢酶，参与三羧酸（TCA）过程中氧化异柠檬酸循环。

在施加抗生素的条件下，大肠杆菌的经典进化示意图和特征描述，A 图描述了大肠杆菌的进化方案；B图描述了在抗生素的条件下的细菌的存活状况；C图描述了在存活率开始下降的后五天每个样本的最早死亡的时间节点（用第五天保存的菌株进行复苏）；D图描述了克隆单体与菌群的生长状况；E图描述了在最低抑制浓度的菌株的生长状况；F图展示了测序样本的选择 ；G、H 图描述了SNP 与 indels等突变情况；I描述了三种抗生素相关基因SNP突变的数目；L描述了KEGG功能注释的情况

2 Evolving antibiotic resistance using a metabolic-dependent approach

以温度来控制代谢活动，每天整加1摄氏度，来讲进行抗生素的进化选择；下图结果表明，存活率的增加是由于获得性抗性，而不是由于延迟耐受（图2D-F)。尽管最低培养基的MIC在群体水平上没有增加，对96个个体克隆的分析显示，与祖先菌株相比，平均而言，分离株表现出MIC增加（图2G)。

3Knockout and overexpression confirm genetic underpinnings of antibiotic resistance

为了评估这些代谢突变是否产生耐药性，我们根据其患病率和临床意义（图3A），我们选择了与代谢相关的基因（sucA，gltD，ushA，icd，ycgG和yidA）和经典抗性（ompF，acrD和gyrA）的代表性子集。代谢突变使MIC增加到至少一种抗生素，而且在许多情况下超过一种抗生素（图3B）,在所有情况下，代谢突变体至少对抗生素的一种耐药，与相应的MIC一致水平,这表明，代谢突变可能影响表达水平和/或催化活性，而不是蛋白质结构或功能，尽管这种机制效应并不明显。总的来说，这些结果表明，这些临床相关的代谢变异确实具有耐药性。众所周知，抗生素刺激的代谢活动导致有毒代谢物质的形成。因此，我们推断耐药性可能源于多种策略之一，包括降低对氧化应激的敏感性或防止抗生素诱导的三羧酸(TCA)循环的刺激。为了研究这些可能性，我们重点研究了sucA(sucAM)中的代谢突变，它对碳水化合物具有高水平的保护作用。我们使用RNA测序来比较存在或不存在carb处理时sucAM和WT之间的基因表达差异.与WT细胞相比，WT细胞对carb和近300个差异表达基因表现出明显的转录转变（DEGs），SUCAM与其未经处理的对照没有区别，只有17DEGs。层次聚类和基于KEGG的途径分析揭示了两种明显的表型：响应carb的WT代谢基因显著上调（P<0.05，Fisher精确检验）和核心代谢途径中的整体下调活性，例如SUCAM中的中枢和能量代谢。

综合起来，这些结果表明，这种抗性可能通过绕过carb介导的TCA活化而发生，可能与较低的总体基础呼吸速率有关。

主要结论：

典型的耐药机制通常仅分为三大类：靶向修饰，药物失活和药物转运。该篇研究结果表明，代谢突变是对抗生素治疗产生的，并且这些突变赋予了耐药性并且这种现象在临床病原体中非常普遍。实际上，代谢适应可以代表一类抗性机制，其中除了赋予耐受性之外，细胞改变其代谢反应以减轻抗生素致死性的下游毒性方面。沿着这个思路，即使是经典的突变，例如调节元件或外排系统中的突变，也出现在经典进化和代谢进化中；这些突变是否出现是因为它们降低了结合靶标的浓度或使随后的应激反应最小化尚不清楚。然而，已知的是，体内抗生素动力学变化很大，很少遵循简单的连续梯度。因此，实施新的方案以增加可获得的进化途径可以促进新的抗性机制的发现，从而增强我们限制抗生素抗性发展和传播的能力。

综上所述为：在抗生素治疗中，发生代谢突变，其赋予了细菌耐药性；细菌通过代谢适应机制，改变一些代谢反应，从而抵抗抗生素对其的毒力伤害。