自2020年初开始，由新冠病毒SARS-CoV-2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2）引起的COVID-19 (coronavirus disease 2019) 肺炎疫情已经在世界范围内流行超过了两年的时间，截止到2022年3月29日，全球已有481,756,671例确诊病例，其中包括6,127,981例死亡病例，目前依然看不到疫情结束的时间线。追踪病毒的遗传信息发现，与最初分离的病毒原始株比较，新冠病毒在这两年多的时间里已经发生了多轮演化，产生了多个变异株，这些变异株在传播性、致病性等方面均发生了改变，从而给全球疫情大流行带来了新的不确定性。本文试从病毒侵入宿主细胞的角度介绍病毒变异株为何会引起一波又一波的疫情流行。

追踪SARS-CoV-2变异株

      世界卫生组织WHO（World Health Organization，https://www.who.int/）联合PANGO (Phylogenetic Assignment of Named Global Outbreak, https://cov-lineages.org/)，GISAID (Global Initiative on Sharing All Influenza Data, https://www.gisaid.org/)，NextStrain（https://nextstrain.org/）这三家国际机构对不断出现的SARS-CoV-2病毒变异株进行监测和追踪。

表1. 需要关注的SARS-CoV-2变异株（WHO网站）

      依据病毒变异株的风险程度，WHO将病毒变异株归为需要监测（variants under monitoring, VUM）、需要关心（variants of interest, VOI）、需要关注（variants of concern, VOC）和高风险(variants of high consequence, VOHC)等不同类别。已检测出来的SARS-CoV-2变异株被归为VUM、VOI和VOC等三类，未有被归为VOHC类，其中，归为VOC类的变异株是引起COVID-19疫情在全球范围内几波大流行的主要类型（表1）。

SARS-CoV-2基因组

      新冠病毒SARS-CoV-2是一个单链正义RNA病毒，基因组大小约为30 kb，组成14个开放阅读框（open-reading frames, ORFs）【1】（图1）。位于5‘端的是ORF1a和ORF1b，分别编码了11个和5个非结构蛋白（non-structural protein, nsp1-16），这些蛋白在病毒RNA复制、蛋白加工等方面发挥作用。位于3‘端’的12个ORFs负责编码结构蛋白和辅助因子。其中的病毒包膜（envelope, E），核衣壳（nucleocapsid, N），膜蛋白（membrane, M）和刺突蛋白（spike, S）作为结构蛋白组成病毒颗粒，辅助因子ORF3a, 3b, 6, 7a, 7b, 8, 9a, 9b, 10则参与调控病毒与宿主细胞及免疫系统的相互作用。

图1. 新冠病毒SARS-CoV-2基因组结构示意图（来源于参考文献[1]）

SARS-CoV-2侵入宿主细胞的途径

      新冠病毒的刺突蛋白由1273个氨基酸（amino acid, aa）残基组成，分为S1和S2两个亚基（图1）。S1亚基含有一个NTD（N-terminal domain）结构域和一个RBD（receptor-binding domain）结构域，负责识别宿主细胞的受体蛋白ACE2（angiotensin converting enzyme 2）。S2亚基则负责协助病毒与宿主细胞之间的膜融合过程。可见，新冠病毒的刺突蛋白是其侵入细胞的关键。

      冠状病毒在刺突蛋白S1和S2亚基的连接处往往只有一个精氨酸（arginine, R），与此不同，SARS-CoV-2在S1和S2连接处含有由多个精氨酸残基（aa681-685，PRRAR）组成的位点【2, 3】。这与中东呼吸综合征冠状病毒MERS-CoV（middle east respiratory syndrome coronavirus）的刺突蛋白在S1/S2连接处也含有类似位点（PRSVR）相似。SARS-CoV-2病毒颗粒在宿主细胞中完成组装后，S1/S2位点则被宿主细胞的蛋白酶Furin识别并切割，因此，成熟的SARS-CoV-2病毒的刺突蛋白由两个非共价结合的S1和S2亚基组成。其中的S1亚基与ACE2结合后将暴露出位于S2亚基上的另外一个切割位点S2’，S2’能够被位于目标细胞表面的跨膜丝氨酸蛋白酶TMPRSS2 (transmembrane protease serine 2)识别切割，也能被位于目标细胞中内体区室的半胱氨酸蛋白酶cathepsin L识别切割【4】。

      目前发现SARS-CoV-2主要通过两条途径侵入宿主细胞【5】。如果SARS-CoV-2的S1亚基与ACE2结合后没有被细胞表面的TMPRSS2识别切割，则病毒-ACE2复合体将通过内吞作用进入细胞，S2’位点则被内体中的cathepsin L切割，随后，病毒与内体膜融合释放出基因组RNA（图2左）；如果SARS-CoV-2的S1亚基与ACE2结合后被足够的TMPRSS2识别切割，则病毒与细胞膜融合释放出基因组RNA（图2右）。研究证明SARS-CoV-2更多选择依赖TMPRSS2的相关途径侵入人体细胞【6】。

图2. 新冠病毒SARS-CoV-2侵入宿主细胞的两条途径（来源于参考文献[5]） 

      人体肺部细胞只表达TMPRSS2，并不表达cathepsin L，因此，SARS-CoV-2想要侵入肺部细胞需要利用TMPRSS2这条途径。已有研究表明，Furin介导的S1/S2位点切割，对于侵入TMPRSS2依赖的宿主细胞是必需的，而对于cathepsin L依赖的宿主细胞则不是必需的【2】。如果SARS-CoV-2的刺突蛋白没有被Furin蛋白预先切割，它们将会通过内吞途径进入细胞，也有可能无法有效进入细胞。所以，Furin对S1/S2位点的有效切割也被认为是SARS-CoV-2做好侵入宿主细胞准备的关键步骤。

变异株的刺突蛋白突变

      SARS-CoV-2刺突蛋白通过S1亚基结合受体ACE2并通过S2亚基与细胞膜融合侵入细胞。虽然新冠病毒的nsp14蛋白作为3‘-5‘核糖核酸外切酶【7】，在病毒RNA复制中具有校对功能，可以减少病毒RNA的突变积累，但是，SARS-CoV-2在世界范围内的大量传播还是增加了突变的积累（图3）。一定的变异，尤其是位于刺突蛋白的突变，会改变ACE2结合、TMPRSS2切割、免疫逃逸等，从而改变病毒的传播性和致病性【8】。自2020年初以来，从SARS-CoV-2病毒变异株阿尔法（Alpha）到奥密克戎（Omicron），每一次都引起全球新一波的疫情大流行，特别地，从2021年11月开始一直流行至今的Omicron更是表现出极强的传播力。

      与VOC类的其他变异株相比，Omicron表现出多个新的特征：一是传播速度非常快，短时间内即成为全球主流毒株；二是感染者表现出无症状或者轻微症状，隐匿性强不易发现；三是Omicron能感染那些曾经感染过新冠病毒或者已经接种过疫苗的人；四是Omicron几乎在同一时间出现三个亚系（BA.1、BA.2、BA.3），其中BA.1.1 (BA.1+R346K)和BA.2已经成为当前全球新冠疫情的主流毒株。

图3. 新冠病毒VOC变异株的刺突蛋白突变位点比较（自制图） 

(A) 刺突蛋白氨基酸位置示意图, NTD (N-末端结构域), RBD (受体结合结构域), RBM (受体结合基序), 并且标示出S1/S2和S2'这两个切割位点. (B和C) 比较Alpha, Beta, Gamma, Delta和Omicron BA.1氨基酸错义突变 (B)和缺失/插入突变 (C). (D) 比较Omicron BA.1和BA.2 氨基酸错义突变位点. 

      Omicron这些新特征推测与其刺突蛋白的突变积累密切相关。与先前的Alpha、Beta、Gamma甚至Delta变异株相比，Omicron在刺突蛋白积累了超过三十个突变位点，其中，BA.1含有37个突变位点，BA.2含有31个突变位点（图3）。与BA.1和BA.2相比，BA.3像是此二者的结合，其刺突蛋白所含的33个突变位点中有31个包含在BA.1的37个突变位点中（ins215D、S371L、G496S、T547K、N856K、L981F除外），另外2个（S371F、D405N）则可以在BA.2的突变位点中找到。

Omicron变异株的强与弱

      Omicron超强的传播力，可能与它进入细胞的途径有关。新冠病毒的其他变异株通过ACE2受体与宿主细胞结合，再依赖TMPRSS2切割S2’位点激活刺突蛋白从而侵入细胞。但是，Omicron似乎不再依赖TMPRSS2蛋白，而是选择内吞途径使整个病毒抢先进入细胞【9】。由于人体鼻腔细胞都能产生ACE2受体蛋白，但是几乎不能产生TMPRSS2蛋白，因此，Omicron直接通过鼻腔吸入后就可以侵入细胞开始繁殖，无需像其他变异株那样依赖TMPRSS2侵入肺部细胞后才开始繁殖。与此一致的是，Omicron在上呼吸道以及体外培养的鼻腔细胞中的复制速度较之前的变异株都要更快【10, 11】。另外，Omicron在刺突蛋白积累的多个突变，也可能帮助其有效逃避中和抗体对其侵入细胞的阻碍作用，从而大大增强它的传播力。

      Omicron虽然传播力异常强，但是它的毒力较之前的变异株似乎要弱一些。关于这一点目前有两种解释：一方面可能与Omicron主要感染上呼吸道细胞，比较少感染肺部细胞有关，由于肺是新冠病毒造成最大损伤的器官，肺部受感染的细胞少则意味着症状轻；另一方面也可能是因为被Omicron毒株感染的人群由于接种过疫苗或者曾经感染过新冠病毒已经获得了部分对抗病毒毒力的抗体。不论如何，接种疫苗依然是当前对抗新冠病毒的最有效途径，至少可以帮助感染者避免出现重症和危重症。Omicron是否会进一步演化改变其致病性，又或者SARS-CoV-2是否会演化出不同于Omicron的新的变异株，这些都是未知数，需要持续地监测追踪。

结语

      从2003年春的SARS-CoV算起，本世纪在过去短短的二十年里，人畜共患病的冠状病毒SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2已经引起了几次人类疾病大流行。尤其是2020年以来肆虐全球的SARS-CoV-2，更是在流行范围、感染人数和死亡人数等方面造成了令人难以置信的影响，并且显而易见地改变了我们的生产生活方式。

      当2020年刚出现SARS-CoV-2引起COVID-19疫情的时候，我在科学网博客上写了一篇博文《新型冠状病毒的那些事儿》，当时还是抱着比较乐观的心态，预计疫情将与2003年的情形相仿，大致到当年夏天就能基本结束。未曾想到，时隔两年后的今年夏天也未必能等来新冠疫情的完全结束。如果参考1918年西班牙大流感的时间线，也许，我们可以期待COVID-19疫情有望在不久的将来结束。

      COVID-19疫情将以怎样的方式结束？我想可能会以这样两个方向相互叠加的方式结束：从人群角度看，普遍接种完全程疫苗或者感染过SARS-CoV-2，已经广泛构建起对新冠病毒的免疫屏障；从SARS-CoV-2角度看，病毒的持续演化产生出具有更快传播速度但是更小致病性的变异毒株，对人的致死率降到一个较低水平（比如接近流感病毒的致死率）。

      与1918年相比，人类对抗病毒的办法多了疫苗；与2003年相比，人类监测追踪病毒的办法多了核酸测序。未来，人类将不可避免地遭遇可能更加来势汹汹的病毒，我们将要为此准备哪些可行的办法？这是值得深思和需要着手开始的事情。

参考文献

[1] Ramesh S. et al., Emerging SARS-CoV-2 Variants: A Review of Its Mutations, Its Implications and Vaccine Efficacy. Vaccines (Basel) 9,  (2021).

[2] Hoffmann M. et al., A Multibasic Cleavage Site in the Spike Protein of SARS-CoV-2 Is Essential for Infection of Human Lung Cells. Mol. Cell 78, 779-784.e775 (2020).

[3] Peacock T. P. et al., The furin cleavage site in the SARS-CoV-2 spike protein is required for transmission in ferrets. Nat. Microbiol. 6, 899-909 (2021).

[4] Takeda M., Proteolytic activation of SARS-CoV-2 spike protein. Microbiol. Immunol. 66, 15-23 (2022).

[5] Jackson C. B. et al., Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 23, 3-20 (2022).

[6] Ou T. et al., Hydroxychloroquine-mediated inhibition of SARS-CoV-2 entry is attenuated by TMPRSS2. PLoS Pathog. 17, e1009212 (2021).

[7] Bai C. et al., Overview of SARS-CoV-2 genome-encoded proteins. Sci. China Life Sci. 65, 280-294 (2022).

[8] Mistry P. et al., SARS-CoV-2 Variants, Vaccines, and Host Immunity. Front. Immunol. 12, 809244 (2021).

[9] Meng B. et al., SARS-CoV-2 Omicron spike mediated immune escape and tropism shift. Preprint at bioRxiv, doi: https://doi.org/10.1101/2021.12.17.473248 (2022).

[10] Hui K. P. Y. et al., SARS-CoV-2 Omicron variant replication in human bronchus and lung ex vivo. Nature 603, 715-720 (2022).

[11] Peacock T. P. et al., The SARS-CoV-2 variant, Omicron, shows rapid replication in human primary nasal epithelial cultures and efficiently uses the endosomal route of entry. Preprint at bioRxiv, doi: https://doi.org/10.1101/2021.12.31.474653 (2022).