小胶质细胞是中枢神经系统中最主要的常住免疫细胞，遍布整个中枢神经系统，其数量约占中枢神经系统中所有细胞的10-15%。作为存在于神经系统中的一类特殊的巨噬细胞，在很长一段时间内，小胶质细胞被认为主要承担清除细胞碎片等废物的功能。近年来的研究表明，小胶质细胞不仅仅是神经系统的“清道夫”，更是维持中枢神经系统稳态的关键细胞。在正常生理状态下，小胶质细胞对环境进行持续的免疫监视，并在识别到免疫刺激时进行快速应答。除了执行免疫功能之外，小胶质细胞也通过突触修剪、神经元兴奋性调节等方式，参与调控神经环路的发育和可塑性。考虑到小胶质细胞的重要功能，几乎所有中枢神经系统疾病的发生和发展均涉及小胶质细胞。人类遗传学研究发现，绝大多数神经退行性疾病的风险基因都在小胶质细胞中特异性表达或高表达。影响小胶质细胞吞噬、激活或免疫调节功能的基因突变也导致严重的中枢神经系统病变。因此，小胶质细胞也被认为是治疗中枢神经系统疾病的重要靶点。

虽然小胶质细胞逐渐成为神经科学研究领域的热点，目前对小胶质细胞功能的理解还不深入，针对小胶质细胞开展研究也相对而言比较困难。一个最主要的技术难点是缺乏高效的手段对小胶质细胞进行转基因操作。以往研究主要通过构建转基因小鼠将外源基因或遗传修饰导入小胶质细胞。但这种手段费时费力，并且不能作为治疗策略进行转化应用。近年来，重组病毒载体，尤其是腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus, rAAV）载体，逐渐成为神经科学研究领域最为重要的研究工具。通过rAAV载体将外源基因（如光敏感蛋白、荧光探针、CRISPR组分等）表达至细胞内，研究人员能够高效的对目标细胞进行标记和操控。这一策略已经被广泛运用于对神经元和神经环路的研究，极大地推动了相关领域的发展。由于相对较高的安全性，rAAV也是现阶段最为常用的基因治疗载体之一。然而，现有的病毒载体均无法实现对小胶质细胞的有效侵染。

在最新这篇论文中，研究人员针对野生血清型AAV9的衣壳蛋白进行改造。AAV由衣壳蛋白和单链DNA基因组所构成，其侵染特性由衣壳蛋白所决定。研究人员将7个随机氨基酸组成的短肽插入至AAV衣壳蛋白的特定位置中，并利用这些突变衣壳蛋白包装制备AAV突变病毒文库。文库中不同的rAAV病毒颗粒表面展示有不同序列的短肽。研究人员首先在体外培养的小鼠小胶质细胞中对该文库进行两轮筛选，鉴定出两个衣壳蛋白（AAV-cMG.WPP和AAV-cMG.QRP）能够在一定程度上提高rAAV病毒对体外培养的小鼠小胶质细胞的侵染效率。以此为基础，研究人员针对AAV-cMG.QRP的插入肽段及其在衣壳蛋白插入位点的相邻氨基酸进行突变筛选，成功得到了高效侵染体外培养小胶质细胞的AAV-cMG衣壳蛋白。通过RNA测序，研究人员确认AAV-cMG侵染体外培养小胶质细胞并不导致小胶质细胞的激活。

图1：体外筛选得到AAV-cMG

然而，体外筛选得到的这些AAV突变衣壳蛋白并不足以在小鼠脑内介导高效的小胶质细胞基因递送。研究人员进一步在AAV-cMG.WPP基础之上构建新的AAV突变文库，并在小胶质细胞特异的Cx3cr1-CreER转基因小鼠脑内进行针对性体内筛选，成功鉴定得到两个衣壳蛋白，AAV-MG1.1和AAV-MG1.2，能够在体内高效侵染小胶质细胞。同样的，通过单细胞测序，研究人员确认AAV-MG1.1和AAV-MG1.2介导的侵染并不导致脑内小胶质细胞的激活。

图2：体内筛选得到AAV-MG1.1/1.2

这些新型rAAV病毒载体能够将众多基因编码的工具蛋白直接递送入小胶质细胞，无需针对每一个工具蛋白重新构建新的转基因小鼠品系，从而大大提高了研究的效率。更重要的是，这些新型rAAV病毒载体使得对小胶质细胞进行快速基因编辑成为可能。研究人员利用AAV-MG1.2结合Cre-LoxP系统，在小鼠脑内小胶质细胞中特异表达钙离子荧光探针jGCaMP8s和北京大学李毓龙实验室最新开发的ATP荧光探针GRAB_ATP1.0，并运用在体双光子成像观察腹腔注射LPS后小胶质细胞胞体处钙离子和ATP分子的动态变化。研究人员同样利用AAV-MG1.2结合CRISPR/Cas技术，实现小胶质细胞高效在体基因敲除。

图3：AAV-MGs介导小胶质细胞在体基因敲除

综上，该研究成功开发了两类分别适用于体外侵染培养小胶质细胞和体内侵染内源性小胶质细胞的新型rAAV载体，拓展了各种研究手段被用于小胶质细胞研究的可行性，并有希望应用于小胶质细胞基因疗法的开发。

北京生命科学研究所罗敏敏实验室林睿博士、北京脑科学与类脑研究中心载体工程中心周宥彤、罗敏敏实验室严婷、王睿宇为本文共同第一作者。该论文的其他作者还包括罗敏敏实验室黎亨、北京脑科学与类脑研究中心张忻爽、周向宇、张力博士、赵非博士，以及北京大学武照伐博士和李毓龙博士。林睿博士和罗敏敏博士为本文共同通讯作者。

该研究受科技部、中国医学科学院及北京市政府资助，在北京生命科学研究所和北京脑科学与类脑研究中心完成。

本文第一作者林睿博士已在北京生命科学研究所成立独立实验室。林睿实验室开发和利用新技术对小胶质细胞生物学开展系统研究，具体信息参见实验室网站https://linlab.bio或联系linrui@nibs.ac.cn，欢迎博士生、博士后和科研助理加入。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1038/s41592-022-01547-7