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NAR-2018-dbCAN2鉴定宏基因组CAZYome碳水化合物相关基因

已有 6764 次阅读 2018-10-1 09:09 |个人分类:软件|系统分类:科研笔记

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宏基因组数据分析中,经常会使用多种多样的数据库,如综述型的有NCBI非冗余核酸或蛋白序列库(NR)、KEGG、COG、eggNOG、RFAM等。专业型的数据库有CAZy(碳水化合物酶)、ARBD(抗生素抗性基因)、CARD、VFDB、PHI等众多数据库。同时基于这些数据库,又开发了很多软件、和在线服务器(web server)方便同行使用。

今天带大家来学习一下CAZy数据库的使用。这里推荐一个今年刚发表在核酸研究(IF>11)的webserver,方便大家鼠标点点,轻松完成宏基因组碳水化合物酶组学的注释。

Science哈扎人CAZYome分析实例

之前精讲过一篇Science封面文章,如下:

正文仅有3个主图,图2的宏基因组部分就围绕着碳水化合物代谢相关基因组(CAZYome)进行的研究。今天就带大家学习一下它是如何实现。

先回顾一下Science图2的主要结果。

实例解读

本图主要基于宏基因组测序碳水化合物代谢基因的种类、丰度进行分析,揭示哈扎人菌群功能周期的变化和与现代人的差别。

本图有8个子图分为5组,从5个不同的角度/主题进行说明。

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图2. 哈扎人肠道菌群功能随季节周期循环

(A) 箱线图展示宏基因组CAZYome基因Shannon多样性按季节变化和与现代人比较;

(B) PCA分析CAZYome表明哈扎人与现代间此类基因显著差异即为样品间主要差异;

(C) 动植物碳水化合物/粘多糖占CAZYome中比例在哈扎人和现代人间存在显著差异;

(D) 几种CAZymes丰度在哈扎人中周期变化,以及与现代人比较

(E) 抗生素抗性基因多样性,哈扎人低于现代人,且存在季节周期变化

点评:宏基因组中从整体到类别,可分析的结果很多,但结果是用于服务科学问题和故事主线的。其中饮食的不同,主要影响碳水化合物的比例和组成,以及抗性基因的种类和丰度。因此选定好的逻辑出发点和故事主线是高水平文章的重点,这个别人很难帮你。但你有了好思路,找技术达人合作或与课题负责分析的朋友沟通,那是水到渠成和锦上添花的事,即使花费大量时间去美化都是值得的。当然也可自学差异箱线图绘制。

分析方法探索(顺藤摸瓜)

看完以上结果,我们会感觉工作很漂亮。但如何实现呢?这是一个大问题。我们接下来查找文章的方法。

Science文章,正常只有2-3页,大部分是结果,很少会有版面去描述方法。我们从文章主页下载的补充材料。有宏基因组分析方法描述如下:

宏基因组测序分析

使用DeconSeq去除人类基因组数据。32个HMP人作为对照同哈扎人相同方法分析。DynamicTrim对宏基因组数据质控,FragGeneScan鉴定编码基因。数据采用HUMAnN2分配至KEGG数据库。HMMER 3.0(45)使用dbCAN鉴定CAZymes(46);使用ResFams鉴定抗生素抗性基因(47),E-value < 1e-5。

  1. S. R. Eddy, A new generation of homology search tools based on probabilistic inference. Genome Inform. 23, 205–211 (2009). http://hmmer.org/
  2. Y. Yin, X. Mao, J. Yang, X. Chen, F. Mao, Y. Xu, dbCAN: A web resource for automated carbohydrate-active enzyme annotation. Nucleic Acids Res. 40, W445–451 (2012). http://cys.bios.niu.edu/dbCAN2/
  3. M. K. Gibson, K. J. Forsberg, G. Dantas, Improved annotation of antibiotic resistance determinants reveals microbial resistomes cluster by ecology. ISME J. 9, 207–216 (2015). http://www.dantaslab.org/resfams

我们列出了与CAZymes相关分析的方法段落,发现是使用dbCAN工具的HMMER方法鉴定的CAZymes,分别对应了引文45和46。再阅读这两篇文章,找到相关软件和数据库的主页,发现了分析CAZymes的在线服务器dbCAN2,它整合了最新的数据库和三种方法,我们可以轻松在线完成分析。

dbCAN2——碳水化合物在线分析服务器

文章:https://academic.oup.com/nar/article/46/W1/W95/4996582
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dbCAN2于今年5月16日在线发表于《核酸研究》杂志(IF=11.561),它是上文Science使用的dbCAN的升级版。知道为什么出2吗?第一版2012年出表至今已经引用571次了。
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dbCAN2简介

网址:http://cys.bios.niu.edu/dbCAN2/

dbCAN2宏基因组服务器自动化碳水化合物酶注释。相关的网站有CAZy, CAT(过时)和Hotpep。

dbCAN2的分析的主要步骤如下:

  • 可提交基因组或宏基因组序列fna文件。真核基因组请使用蛋白序列faa文件
  • 自动化注释分三步
    • 基于dbCAN CAZyme结构域HMM数据库,HMMER注释CAZYme结构域的边界
    • DIAMOND注快速释blast比对CAZy数据库
    • Hotpep基于PPR文库鉴定短保守motifs
  • 提交faa + gff文件,服务器使用CGC-Finder可鉴定转录因子TF、转动蛋白和CAZyme基因簇(CGCs)。
  • 结果可以可视化,如维恩图多方法比较。提供比对结果表格下载。

本服务器每年更新一次CAZy数据库。

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主页上有5个菜单,分别主页简介(Home)、在线注释(Annotate)、下载本地版(Download)、帮助(Help)和联系作者(About us)

详细的教程可见帮助页。

在线分析

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在线分析基本原理如上图。DNA进行预测蛋白。再进行三种方法(HMM, diamond, hotpep)的预测。

点击Annotate在线注释

下图以蛋白序列为例。核酸序列,软件还会利用Prodigal自动预测蛋白。

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  1. 填写E-mail,任务完成时获得结果链接;
  2. 序列类型,可选fasta核酸或蛋白序列
  3. 工具选择。默认只选了HMMER,一般也够用了。可以再选diamond、hotpep和CGCFinder。
  4. 基因位置文件gff/bed格式(可选),蛋白则不需要;
  5. 序列文件,少量可粘贴,大量则上传文件,要求小于100M。

点击Submit就等着收结果吧。运行完成见如下页面。即使关闭,会收到结果页的链接。

image

上面维恩图,是用三种注释方法结果的比较。下面为注释结果的总结,和每种方法的结果。可以下载结果表格。也可以查看每种方法比对结果的详细。

要想查看每种CAZy酶的注释,可以点击蓝色的链接,跳转CAZy官网查看。

image

基于注释的结果,对我们宏基因组基因丰度矩阵进行筛选,就可以进行CAZyome的分析了。是不是挺容易的。

本地软件和数据库下载

http://cys.bios.niu.edu/dbCAN2/download/

有本平台所有的软件和数据库,查看README.txt

The Tools directory contains tools used in dbCAN meta server. These include CGC-Finder, the Python verson of Hotpep, and a parser for HMMER. 

The Databases directory contains all the databases used in dbCAN meta server. These are CAZy, dbCAN, PPR, tcdb, and tf.

README.txt            this file

Tools/
    CGC-Finder.tar.gz    CGC-Finder program
    hmmscan-parser.tar.gz    分析hmm结果文件的脚本Script to parse hmmscan output of dbCAN search
    hotpep-python.tar.gz    Hotpep program and data
    run_dbcan.tar.gz    dbcan运行脚本 Script to run a stand alone version of dbCAN meta

Databases/
    dbCAN-old@UGA/        Data in the old dbCAN server@UGA
    tcdb.fa            转运蛋白注释 transporter proteins annotated at http://www.tcdb.org/
    tf.fa            转录因子 transcription factor proteins annotated at collectf DB, RegulonDB, and DBTBS
    CAZy.08312018.fa    CAZy数据库 GenBank proteins annotated as CAZymes by CAZy
    dbCAN-HMMdb-V7.txt    模型 dbCAN HMM DB

碳水化合物蛋白数据库

CAZyDB.07312018.fa 蛋白序列520Mb,可以用diamond比对

序列名为GeneBankID,和分类

AWI06117.1|GT2

CAZyDB.07312018.fam-activities.txt 分类描述文件

AA10      AA10 (formerly CBM33) proteins are copper-dependent lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs); some proteins have been shown to act on chitin, others on cellulose;

CAZyDB.07312018.pr-with-ec.txt 基因对应酶学编号

AAC00570.1      GT1|2.4.1.195

HMM数据库

dbCAN-HMMdb-V7.txt HMM模型

dbCAN2具体的本地安装涉及较多软件和数据库的布置,有时间写个专门的文章进行讲解。本文讲的在线版分析可以满足大多数同行

Reference

  1. Smits, Samuel A., et al. “Seasonal cycling in the gut microbiome of the Hadza hunter-gatherers of Tanzania.” Science 357.6353 (2017): 802-806. http://science.sciencemag.org/content/357/6353/802
  2. 附件目录 http://science.sciencemag.org/content/suppl/2017/08/24/357.6353.802.DC1
  3. 补充方法 http://science.sciencemag.org/content/sci/suppl/2017/08/24/357.6353.802.DC1/aan4834_Smits_SM.pdf
  4. 附表1. 样品列表 http://science.sciencemag.org/highwire/filestream/698500/field_highwire_adjunct_files/1/aan4834_Table_S1.csv
  5. 附表3. KEGG通路表 http://science.sciencemag.org/highwire/filestream/698500/field_highwire_adjunct_files/2/aan4834_Table_S3.csv
  6. 附表4. KEGG Carbohydrate Metabolism pathways http://science.sciencemag.org/highwire/filestream/698500/field_highwire_adjunct_files/3/aan4834_Table_S4.csv
  7. Zhang, Han, et al. “dbCAN2: a meta server for automated carbohydrate-active enzyme annotation.” Nucleic acids research (2018).
  8. http://cys.bios.niu.edu/dbCAN2/

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写在后面

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