西北农林科技大学联合北京畜牧兽医研究所公布了世界上首个肠道原虫基因组目录，并发现其是一类可比肩肠道真菌的降解微生物，颠覆百年认知

2022年8月19日，西北农林科技大学姜雨团队、北京畜牧兽医研究所姚斌院士团队和美国俄亥俄州立大学于忠堂教授在ISME Journal杂志上发表了一篇题为 Genomic insights into the phylogeny and biomass-degrading enzymes of rumen ciliates 的文章。本项目团队公布了世界上首个瘤胃原虫的基因组目录，发现其是一类可媲美肠道真菌的降解微生物，并理清了其系统发育关系和分类学框架，鉴定出1个新的科，2个新的属和2个新的种。

牛羊等反刍动物可以将人类不可食用的植物秸秆等资源转化人类可食用的高质量的肉和奶，缓解了人畜争粮的问题。这一功能归因于反刍动物强大的瘤胃微生物发酵系统。近年来，相继发表万余个瘤胃细菌、古菌和真菌的基因组，并解析了其系统发育学和生态功能。而瘤胃原虫是人类最早(1843年)发现的一类瘤胃微生物，其可占据瘤胃微生物生物量的50%，且在瘤胃微生态系统中扮演着重要角色，比如与细菌的捕食、共生和竞争关系。但由于其不能纯培养，而通过传统的单培养和驱除原虫的方式均不能排除共生微生物的干扰，其代谢功能一直是个未解之谜。由于原虫捕食细菌且与甲烷菌具有共生关系，科学家们倾向于认为瘤胃原虫对饲料降解和环境保护是不利的，并进行了长达近百年的驱除试验。本团队成员之前的研究发现，驱除原虫仅短期会降低瘤胃甲烷产量，长期反而提高了甲烷产量，而且驱除原虫后瘤胃纤维降解率会降低(JASB，2018)。这种有悖于传统认知现象，驱动了团队进一步的机理探究。此项目旨在通过基因组的手段规避细菌和古菌等共生微生物的干扰，进而通过比较基因组学和功能基因组学的手段解析其系统发育、基因组进化和生态功能。

通过创建整套纤毛虫单细胞全基因组测序的组装和识别流程，共获得了奶牛、肉牛和奶山羊瘤胃中22个形态种的52个高质量基因组(完整度>80%)。在52个高质量基因组中，具有端粒的序列占基因组总序列的14%-92% (平均61%)。其中Oph. caudatus SAGT3完整染色体数量高达26,497条，另外其还有33,578条具有单端端粒的不完整染色体，所以其染色体的数量至少有43,286条。这远高于已发现的水生纤毛虫的染色体数量，Oxytricha trifallax (16,000)、Halteria grandinella (23,000) (Swart et al., 2013; Zheng et al., 2021)，成为目前自然界中发现单倍体染色体数量最高的物种。利用这些基因组构建了瘤胃纤毛虫的分类学和系统发育框架，将22个形态种修改为19个物种和13个属。其中我们发现了9个同义物种和2个隐形物种，提议的2个新的属和1个新的科。另外纤毛虫的片段化（一条染色体仅编码一个基因）和非片段化基因组首次在同一个纲中被发现，通过系统发育关系推测等毛科的非片段化基因组属于独立起源事件。利用构建的纤毛虫的基因组目录对901个已发表的瘤胃宏基因组数据重分析发现，纤毛虫的reads在宏基因组测序reads中可高达72%，平均为12%，这极大地促进了瘤胃宏基因组数据的解析。

图2 瘤胃纤毛虫的系统分类学和系统发育学结果

在52个纤毛虫基因组共预测到33,693个非冗余的碳水化合物活性酶(CAZymes)，其中只有357个可比对到公共数据库上(图4)，表明99%的纤毛虫CAZymes都是未知的。双毛亚科和头毛亚科的物种基因组编码着与肠道真菌相当的CAZymes，而后者是自然界中之前已知生物中编码CAZymes最多的生物。每种瘤胃纤毛虫均具有独立降解植物结构性碳水化合物(纤维素、半纤维素和果胶)、非结构性碳水化合物(淀粉和果聚糖)以及微生物碳水化合物(几丁质和肽聚糖)的能力。同时亚科间在降解底物方面存在不同的投资权衡。双毛亚科 (72%) 和头毛亚科(82%)中大部分的酶被用于植物结构性碳水化合物降解，其次为植物非结构性碳水化合物降解(分别为19%和12%)；而等毛科(45%)、厚毛科(43%)和内毛亚科(46%)大部分的降解酶被用于降解植物非结构性碳水化合物，其次为植物结构性碳水化合物(分别为31%、37%和37%)。瘤胃纤毛虫碳水化合物降解酶的投资组合显示它们的能量主要来源于植物降解，同时亚科间投资差异一定程度上避免了生态位重叠。较宽的营养生态位、底物偏好和植食性共同揭示了纤毛虫能达到一半瘤胃微生物生物量的分子机制。

图4 瘤胃纤毛虫的碳水化合物活性酶特征

水平转移分析发现约63%的瘤胃纤毛虫CAZymes主要通过水平转移(HGT)获得，其中55%来自细菌和8%来自真菌。大多数纤毛虫CAZymes都有一个以上的HGT事件，可发生在瘤胃纤毛虫的早期或物种多样化期间。例如，瘤胃纤毛虫通过26次HGT从细菌和真菌供体中招募了五个基因家族 (GH5、GH10、GH11、GH30和GH43)的木聚糖酶 (EC 3.2.1.8)(15次来自厚壁菌门、6次来自拟杆菌门、4次来自其他菌门、1次来自真菌)。纤毛虫HGT获得的CAZymes与供体间存在明显的结构差异，例如纤毛虫GH5的EC3.2.1.4酶和GH10的EC3.2.1.8酶中均丢失了一个motif。利用毕赤酵母克隆对酶进行过表达这两个酶发现，纤毛虫纤维素酶和木聚糖酶的活性分别比其细菌供体高9倍和2倍。这种高活性反映了纤毛虫酶应用于生物质转化的巨大潜力。

本文的通讯作者为西北农林科技大学姜雨教授和北京畜牧兽医研究所黄火清研究员，第一作者为西北农林科技大学李宗军副研究员、博士生王香南、研究生张禹、美国俄亥俄州立大学于忠堂教授、博士生张婷婷。本研究在国家自然基金(31902126、U21A20247、31822052)和中国博士后基金(2019M663841)的共同资助下完成。

第一作者简介

李宗军，西北农林科技大学副研究员，主要从事反刍动物瘤胃微生物—宿主—营养素的协同进化和互作网络研究。近五年以第一作者发表了The ISME Journal、Science China Life Sciences、3篇Journal of Animal Science and Biotechnology、Journal of Dairy Science、International Journal of Biological Macromolecules等期刊。

于忠堂，美国俄亥俄州立大学教授、博士生导师。Microbiome、Journal of Dairy Science等杂志编辑。研究方向包括家畜肠道微生物与环境微生物生态学研究和生物质废弃物转化的微生物学基础研究等。在The ISME Journal、PNSA和Microbiome等刊物发表文章200余篇，所发文章被引用超过13000次。

通讯作者简介

姜雨，二级教授，博士生导师，西北农林科技大学动物科技学院副院长（主持工作）。国家青年人才计划入选者、国家优秀青年科学基金项目获得者、农业农村部“杰出青年农业科学家”。以第一作者或通讯作者发表高水平国际学术论文50余篇，其中3篇Science、2篇Nat Commun、1篇Sci Adv，成果入选2019年“中国生命科学十大进展”、获省级“自然科学奖”一等奖1项（排名第一）。

黄火清，研究员，博士生导师，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所饲用酶工程创新团队骨干。入选“北京市科技新星”、“杰出青年农业科学家”、“青年英才培育工程”、和“青年拔尖人才”。长期从事酶蛋白高效表达菌株构建及产业化研究，完成技术转让28项次，发表SCI 论文 20余篇，获北京市科技进步一等奖、国家科学技术进步奖二等奖、以及产学研合作创新奖一等奖各1项。

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