实验设计和治疗

      共16例患者组织病理学检查确诊为复发性卵巢癌；对铂类敏感并可接受铂类化疗者符合入组标准。16例患者的入组，治疗和评估的总体分类（图1.）

         入组的16例患者依实体瘤评估标准（RECIST V.1.1）确定为进展性疾病（PD）；或在3个月内确认肿瘤标志物（CA125）峰值超过正常上限2倍；患者预期寿命至少为3个月，体能状态（ performance status）0–2。至少有一个可切除肿瘤用于TILs的分离培养和扩增。至少有一个对病变的可测量指标进行治疗反应评估，或使用CA125来评估临床反应。患有脑转移，严重心脏病，活动性免疫缺陷或自身免疫性疾病，进入研究前2年内有其他恶性肿瘤，对青/链霉素过敏，有乙型/丙型肝炎，HIV，HTLV感染或梅毒血清阳性者,排除此项研究之外。

      联合治疗方案包括6个周期的标准铂类化疗,每3周1次。根据患者体表面积，将卡铂药物浓度指数（AUC）调整为5或6，联合使用紫杉醇 175mg/m²; 若对卡铂过敏，可用顺铂50mg/m²替代。在第1组(无IFNa治疗)，TILs以每3周1次间隔共输注3次，首次输注时间在化疗第2疗程后的第14天（即第0周），第2和3次TILs输注分别在第3和第4化疗周期后的第2周进行。每次静脉输注TILs的数量为1-7.5x10⁸ 细胞，输注时间30-60分钟。患者若未发现病情进展且仍有TILs可用，则给予另1个周期的3次TILs输注，勿需化疗。在第2组(有IFNa治疗)，每周皮下注射1μg/kg，最高剂量不超过90μg/周，在第一次TIL输注前一周开始，总共使用12周。

观察指标 

本项研究的主要目标是评估在CP化疗期间，使用TILs的安全性和可行性；次要目标是评估临床反应，包括最佳整体反应（best overall response，BOR,根据RECIST V.1.1和irRC标准）；疾病控制率（disease control rate，DCR），DCR检查治疗后6个月内的完全缓解（CR）+部分缓解（PR）+病情稳定（SD）的比例；无进展生存期（PFS）；总生存期（OS）；无铂治疗期间（platinum-free interval，PtFI)患者的情况。PtFI是指自最后一次铂类化疗周期结束到首次通过影像学确认疾病进展（PD）的时间，这段时间用来评估患者在化疗间隙期内的生存情况。 

实验室检测指标 

免疫参数评估：包括CP化疗对免疫的调节作用；TILs在有无IFNa情况下的免疫调节作用；血液样本中的免疫反应细胞因子评估：促炎/抗炎细胞因子 IL-6和IL-8；维持稳态细胞因子IL-7，IL-15和IL-21检测；细胞增殖实验和混合淋巴细胞反应（MLR）试验检测淋巴细胞增殖能力和抗原呈递能力；TILs的表型检测使用不同组合的单抗染色，包括激活/抑制/记忆/归巢和Treg等各T细胞亚群的标志；对各批次TILs的肿瘤特异性杀伤功能的评估，是针对一组卵巢癌细胞株为靶细胞，采用干扰素γ释放试验方法检测。 

临床治疗结果 

      除了一例患者外，其他患者都诊断为高分化浆液性卵巢癌。全部患者都接受了CP化疗和TIL输注。两例患者（P1和P8）的疗效和毒副作用未能评估，其余14例患者至少完成了1个完整周期的3次TILs输注治疗，并对肿瘤和免疫反应进行了评估。16例患者的中位数年龄为 61岁 (范围 29–77岁)。38%（6/16）的患者的PtFI（复发与前次治疗之间的间隔时间）在6到12个月之间，而62%（10/16）的患者的PtFI超过12个月（范围为12-55个月）。治疗开始前患者CA125水平在14-928 kU/L（正常值范围0-35 kU/L）之间变化。13%（2/16）的患者检测到BRCA基因突变。 

全部患者的肿瘤样本或活检组织中都成功地培养出了TILs，但部分患者的TILs（P8、P10、P13和P16）需要从另一个病变部位获得额外的活体组织才能完成培养扩增，这反映患者的TILs浸润在不同病变部位之间存在的差异。为达到临床级别足够数量的TILs，通常需要两个阶段的培养过程（初始培养阶段和迅速扩增阶段），初始培养的中位数时间大约为16天（range：9-30天），随后的迅速扩增时间约为14天。TILs扩增的平均倍数为1516倍（range 106-2769倍）。 

采用CP化疗加TILs治疗未使用IFNa的患者，未见有由TILs输入引发的副作用。3例加用IFNa的患者中，2例发生了加重的全血细胞减少症，尤其是中性粒细胞减少症（4级）和血小板减少症（3级），这种程度的毒副作用一定程度上达到了剂量限制性毒性（Dose Limiting Toxicity）。

 对14例做完至少1个完整周期三次TILs输注，且未显著偏离治疗计划的患者进行了临床反应评估。获得最佳整体反应（BOR）的患者中，3例为CR（完全缓解），9例为PR（部分缓解），2例为病情稳定（SD），客观反应率（ORR) 为 86%，6个月时的疾病控制率（DCR）为 100%。本治疗方案在大部分患者中都能获得积极的疗效，使疾病得到控制。对12/14名患者的首次评估，显示肿瘤病灶总和减少超过30％，大部分患者在治疗初期就观察到明显的肿瘤负荷减少的效果。

 治疗后患者的肿瘤标记物（CA125）水平下降，其中12/14名患者的CA125水平降低到正常值上限（35 KU/ml）以下。在铂类化疗和TILs治疗后的无铂治疗期间的病情无进展期（PtFI）持续时间为2到35个月（中位数为6.5个月）；患者（P13和P6，下图的绿色条形图）在接受铂类化疗和TILs治疗后，观察的无进展生存期超过了在他们入组之前最后一次铂类化疗获得的PtFI。P6患者在接受TILs和铂类化疗联合治疗后，持续的无进展生存期（PFS）已增加五倍。铂类化疗重复治疗的临床反应取决于前次治疗后的PtFI，以往的经验认为，每次铂类化疗后的PtFI无进展生存期都会逐渐缩短。患者P6在铂类化疗期间输注TILs后观察到的PtFI远超过前次铂类化疗后的 PtFI（>42 个月 vs 8 个月）预期结果，出现如此持久的疗效可能是由于同时使用了TILs。

总体而言，患者的治疗反应持续时间各不相同，中位数疾病无进展生存期（PFS）为10.7个月（range: 6-39+个月），相应的中位数无铂治疗无进展生存期（PtFI）为6.5个月。到数据分析截至时间点时（2023年4月），Kaplan-Meier生存曲线显示，中位数总生存期的概率为34.7个月（下图）。

 这项研究结果显示，在复发性卵巢癌中采用铂类化疗联合TILs免疫治疗的临床应用是可行和安全的，无需额外使用IFNa。铂类化疗引起的髓细胞减少在第二次化疗后的1-2周时达到最大程度，此时认为是输注TILs的最佳时机。由于铂类化疗与IFNa联用导致剂量限制性毒性，选择毒性较低不会加重化疗相关毒性的IL-2来提高对输入T细胞的支持，可能有助于疗效的提高。 

与其他实体瘤相比，一般认为免疫治疗对复发性EOC疗效尚不明显。此项I/II期临床试验 (NCT04072263)，将评估标准化疗与免疫疗法相结合是否能有效地改善患者的预后。由于本项临床试验是单臂试验，没有单纯化疗对照组，而且病例数太少，因此，还不足以得出有意义的结论。单就本项研究的中位数PFS（10.7个月），横向对比以往铂类药物敏感的复发性EOC化疗历史性数据：Calypso trial，CP化疗 n=507，中位数PFS 9个月和ICON4 trial，n=392，中位数PFS 13个月，提示标准化疗与TILs疗法相结合尚未显示出显著的疗效改善。 

CP化疗加TILs治疗后的无病情进展期PtFI，通常化疗后的每次PtFI都会逐渐缩短。2例患者（P13和P6）的PtFI超过了他们入组之前最后的PtFI间期。患者（P6）的PtFI比TILs治疗前已增加了5倍，表明可能是TILs产生的疗效。CP化疗加TILs治疗后，有3/16例患者（19%）获得了完全缓解,这种疗效比率与PD-1免疫治疗在总体实体瘤患者中的有效率（20%左右）很相近，也可能与CAR-T疗法在实体肿瘤中未见突破有着尚未为人所知的复杂机理和背景。 

说到TILs输注的数量，这项临床研究使用的TILs的数量范围为1-7.5x10⁸，与NCI的Dr. Rosenberg 在乳腺癌治疗使用的TILs数量（3.06 x 10¹⁰ - 1.04 x 10¹¹，median: 6 x 10¹⁰)相差2-3个数量级，不知道是否会对疗效产生影响。对于TILs输注的数量，我个人也并不认为数量越多越好，至于哪个数量级的TILs最为有效，还是需要结合临床研究来确定的。瑞士洛桑大学TILs治疗团队的研究认为,扩增和回输的TILs细胞群体里，并非都对肿瘤细胞具有特异性的杀伤作用，因此建议生成针对肿瘤新抗原的特异性识别能力的新一代TILs，将对提高治疗癌症的疗效有重要作用。因此，对TILs培养扩增技术，质量评估方法以及与临床治疗相关的各项指标临界值的标准化是重要和必须的途径。 

此外，莱顿大学肿瘤科团队的TILs培养过程，初始培养的中位数时间大约为16天（range：9-30天），随后的迅速扩增时间约为14天。初始培养时间似乎过长，我们初始培养激活T细胞的经验，多半在一周左右的时间。或许他们采集的肿瘤样本是来自穿刺的标本，获得的肿瘤组织比较小，需要更长的时间来获得足够的起始T细胞。临床实际上可能需要从活检穿刺获得肿瘤组织，比手术切除更为可行，因此提高初始培养阶段的技术水平非常重要，这里也有技术标准化的需要。 

这项研究也试图证明，CP化疗可以使患者血液样本中髓系来源的抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)的频率显著降低，这有助于提高TILs免疫杀伤作用。下图显示mMDSC/DC 比率高的患者伴有较短的生存期曲线。

      尽管本试验提供了CP化疗可以调整和抑制髓系来源的抑制性细胞的证据。但是临床资料显示MDSCs类抑制性细胞的减少，只是个短暂的过程，化疗之后，通常一周内MDSCs等细胞群体的数量就将回归到原有的状态。因此表明,CP化疗为TILs治疗提供的帮助和促进作用，尚不能持久，有必要探索新的方法，来获得对髓系来源的抑制性细胞的有效和持久的控制，更有效地增强TILs免疫治疗的效果。

仅就本项临床研究的具体结果得出的结论是：在复发性卵巢癌患者中采用铂类化疗联合TILs免疫治疗的临床应用是可行和安全的，无需额外使用IFNa；铂类化疗使至髓类细胞减少在第二次化疗后的1-2周时达到最大程度，此时认为是输注TILs的最佳时机。由于铂类化疗与IFNa联用导致出现剂量限制性毒性，选择毒性较低不会加重化疗相关毒性的IL-2，来提高对输入T细胞的支持，可能有助于疗效的提高。 

Timed adoptive T cell transfer during chemotherapy in patients with recurrent platinum-sensitive epithelial ovarian cancer. J Immunother Cancer. 2023 Nov