一、产品简介：

抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate peroxidase ,APX）也称维生素C过氧化物酶，是植物细胞中防御外界氧化胁迫和植物本身活性氧代谢的重要抗氧化酶类，在降低H2O2对植物细胞产生氧化损伤方面起关键作用。

  APX 催化 H2O2 氧化 AsA，通过测定 AsA 氧化速率，来计算APX 活性。

二、试剂盒组分与配制：

三、需自备的仪器和用品：

酶标仪、96孔板（UV板）、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、冰、蒸馏水。

四、操作步骤：

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、预实验样本制备

① 组织样本：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。 12000rpm，4℃离心 20min ，取上清置于冰上待测。

② 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后，取上清置于冰上待测。

2、预实验上机操作：

① 酶标仪预热30min以上，调节波长至290nm；

② 试剂一置于25℃水浴中预热30min以上；

③ 操作表：

3、正式实验：

① 确定好最适实验条件后，正式实验样本制备同预实验样本制备；

② 正式实验按照预实验上机操作步骤进行

五、结果计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

1、按样本蛋白浓度计算

酶活定义：每mg蛋白每分钟氧化1μmol AsA 为1个酶活单位(U)。

APX(U/mg prot) = [△A÷(ε×d）×V2×10⁶] ÷(Cpr×V1)÷T=1.79×△A÷ Cpr

2、按样本质量计算

酶活定义：每g组织每分钟氧化1μmol AsA 为1个酶活单位(U)。

APX(U/g 质量) = [△A÷(ε×d）×V2×10⁶]÷(W×V1÷V)÷T=1.79×△A ÷W

ε：AsA在290nm处摩尔吸光系数为2.8×10³ L/mol/cm；

d：比色皿光径，1cm；                 10⁶：1mol=1×10⁶μmol；

V：提取液体积，1 mL；            V1：加入反应体系中上清液体积，0.02mL；

V2：反应体系总体积，2×10^-4 L；         T：催化反应时间，2min；

W：样品称重，g；                     Cpr：蛋白浓度(mg/ml)。

b.用 96 孔板测定的计算公式如下:

1、按样本蛋白浓度计算

酶活定义：每mg蛋白每分钟氧化1μmol AsA 为1个酶活单位(U)。

APX(U/mg prot) = [△A÷(ε×d）×V2×10⁶] ÷(Cpr×V1)÷T=3.57×△A÷ Cpr

2、按样本质量计算

酶活定义：每g组织每分钟氧化1μmol AsA 为1个酶活单位(U)。

APX(U/g 质量) = [△A÷(ε×d）×V2×10⁶]÷(W×V1÷V)÷T=3.57×△A ÷W

ε：AsA在290nm处摩尔吸光系数为2.8×10³ L/mol/cm；

d：96孔板光径，0.5cm；                 10⁶：1mol=1×10⁶μmol；

V：提取液体积，1 mL；            V1：加入反应体系中上清液体积，0.02mL；

V2：反应体系总体积，2×10^-4 L；         T：催化反应时间，2min；

W：样品称重，g；                     Cpr：蛋白浓度(mg/ml)。