一、产品简介：

氧化型谷胱甘肽（GSSG）是谷胱甘肽（GSH）的氧化形式，又称为二硫代谷胱甘肽，是两分子的谷胱甘肽氧化而成。还原型与氧化型比值（GSH/GSSG）是细胞氧化还原状态的主要动态指标。因此，测定细胞内GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态。

本试剂盒利用谷胱甘肽能和DTNB反应产生的2-硝基-5-巯基苯甲酸在波长 412nm 处具有最大光吸收的特点，通过 2-乙烯吡啶抑制样本中原有的还原型谷胱甘肽，然后利用谷胱甘肽还原酶将 GSSG 还原为 GSH，还原型谷胱甘肽GSH与DTNB与反应生成复合物，在412nm处有特征吸收峰；其吸光度与GSH含量成正比。

二、试剂盒组分与配制：

三、需自备的仪器和用品：

酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、超声细胞破碎仪、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。

四、操作步骤：

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、预实验样本制备

① 组织样本：称取0.1g样本，加入 1mL提取液，进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清液放置于冰上待测。若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存3天）。【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取。

② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存3天）。【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（10⁶）：提取液（mL）为500~1000：1的比例进行提取。

③ 血液处理

血浆：将收集的抗凝血于600g，4℃离心10min，吸取上层血浆到另一支试管中，加入等体积的提取液，4℃， 8000g 离心 10 分钟，将上清移入新的试管中放置于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存3天）。

血细胞：将收集的抗凝血于 600g，4℃离心10min，弃去上层血浆用3倍体积的PBS清洗 3次（用PBS重悬血细胞，600g离心10分钟），加入等体积的提取液，混匀后4℃放置10分钟，8000g离心10分钟，吸取上清放于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存 3 天）。

2、标准溶液的配制：把10mg/mL（即10000μg/mL）标准品母液用蒸馏水稀释成120，60，30，15，7.5，3.75μg/mL的标准溶液备用。

3、预实验上机操作：

① 酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm。

② 操作表：

4、正式实验：

① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围：高于最高值建议将待测样本用蒸馏水适当稀释后再进行测定，低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定，并将改变后的W代入公式计算；

② 确定好最适实验条件后，正式实验样本制备同预实验样本制备；

③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行（标准管和空白管预实验已做，正式实验可选做）。

五、结果计算：

1、以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的（ΔA标准-ΔA空白）为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将（ΔA测定-ΔA空白）带入方程得到x（μg/mL）。

2、按蛋白浓度计算：

GSSG含量（μg/mg prot）=x×V1÷（V1×Cpr）×D=x÷Cpr×D

3、按样本质量计算：

GSSG含量（μg/g 质量）=x×V1÷(V1÷V×W)×D=x÷W×D

4、按细胞数量计算：

GSSG含量（μg/10⁴ cell）=x×V1÷(V1÷V×N)×D=x÷N×D

5、按液体体积计算：

GSSG(μg/mL)=2x×D

V：上清液总体积，1.0mL；       V1：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；       

W：样品质量，g；               N：细胞数量：以万计；

Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；       2：血浆（血细胞）稀释一倍；

D：稀释倍数，未稀释即为1。

注意事项：

①样本处理需匀浆完全，若当天不能完成测量，可放-80℃保存。

②若不确定样本中 GSSG 含量的高低，可稀释几个梯度后再进行测量。