一、产品简介：

还原型谷胱甘肽GSH（reduced glutathione, GSH）是细胞内最主要的抗氧化巯基物质，在抗氧化、蛋白质巯基保护和氨基酸跨膜运输等中具有重要作用。还原型与氧化型比值（GSH/GSSG）是细胞氧化还原状态的主要动态指标。因此，测定细胞内GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态。

还原型谷胱甘肽GSH与DTNB与反应生成复合物，在412nm处有特征吸收峰；其吸光度与GSH含量成正比。

二、试剂盒组分与配制：

三、需自备的仪器和用品：

酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、超声细胞破碎仪、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。

四、操作步骤：

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、预实验样本制备

① 组织样本：称取0.1g样本，加入 1mL提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm，4℃离心15min，取上清液放置于冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取。

② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000rpm，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（10⁶）：提取液（mL）为500~1000：1的比例进行提取。

③ 液体样本： 直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。

2、标准溶液的配制：把10mg/mL（即10000μg/mL）标准品母液用蒸馏水稀释成400、200、100、50、25、12.5、6.25μg/mL的标准溶液备用。

3、预实验上机操作：

① 酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm。

② 操作表：

4、正式实验：

① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围：高于最高值建议将待测样本适当稀释后再进行测定，低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定，并将改变后的W代入公式计算；

② 确定好最适实验条件后，正式实验样本制备同预实验样本制备；

③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行（标准管和空白管预实验已做，正式实验可选做）。

五、结果计算：

1、以各个标准溶液的浓度为 x 轴，其对应的 ΔA 标准为 y 轴，绘制标准曲线，得到标准方程 y=kx+b，将 ΔA测定 带入方程得到 x（μg/mL）。

2. 按蛋白浓度计算：

GSH 含量（μg/mg prot）=x×V 1÷（V 1×Cpr）=x÷Cpr

3. 按样本质量计算：

GSH 含量（μg/g 质量）=x×V 1÷(V 1÷V×W)=x÷W

4. 按细胞数量计算：

GSH 含量（μg/10⁴ cell）=x×V 1÷(V 1÷V×N)=x÷N

5. 按液体体积计算：

GSH(μg/mL)=x

V：上清液总体积，1.0mL；       V1：加入反应体系中上清液体积，0.02 mL；       

W：样品质量，g；               N：细胞数量，以万计；

Cpr：蛋白质浓度，mg/mL。

注意事项：

①样本处理需匀浆完全，若当天不能完成测量，可放-80℃保存。

②若不确定样本中 GSH 含量的高低，可稀释几个梯度后再进行测量。

③因为提取液中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白含量，需另取组织。