一、产品简介：

PTIO（2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-oxide ）即2-苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-氧代 3-氧化物。是一种用于定量测定生物试样和食品的抗氧化能力。

实验是根据PTIO自由基，在557nm处有一强吸收。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，即A值越低，进而对样本中PTIO清除能力进行分析。

二、试剂盒组分与配制：

三、需自备的仪器和用品：

酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、30-50目筛（干样用）、可调式移液器、甲醇、蒸馏水和冰。

四、操作步骤：

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、预实验样本制备

① 组织样本：称取约0.1g新鲜样本或者称取约0.05g烘干样本（60℃烘干至恒重，粉碎，过30-50目筛，得到烘干样本），加入1mL的提取液（若鲜样需研磨均质），于60℃，200-300W条件下超声提取30min（间隔5min振荡混匀一次），若有损失需用提取液定容至1mL。12000rpm，25℃离心10min，取上清测定。【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取。

② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000rpm 室温离心10min，取上清测定。【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（10⁴）：提取液（mL）为500~1000：1的比例进行提取。

③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。

2、标准溶液的配制：把10mg/mL标准品母液用提取液稀释成5、4、3、2、1、0.5 mg/mL的标准溶液备用。

3、预实验上机操作：

① 酶标仪预热30min以上，调节波长至557nm。

② 操作表：

4、正式实验：

① 不同样本清除能力不一，可先选取2个样本做检测，若A测定-A对照接近零，需对样本进行适当稀释后再检测，稀释倍数D代入公式计算。

② 确定好最适实验条件后，正式实验样本制备同预实验样本制备；

③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行（空白管预实验已做，正式实验可选做）。

五、结果计算：

1、以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的清除率（%）为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将清除率带入方程得到x（mg/mL）。

标准品 PTIO自由基清除率（%）=［(A空白-A标准）÷A空白×100］%

2、PTIO自由基清除率（%）=［(1-（A测定-A对照）÷A空白)×100］%

3、定义：用从标准曲线上获得的抗氧化剂的量来表示样本的PTIO自由基清除能力（U）。

4、按样本质量计算：

PTIO自由基清除能力（U/g质量）=x×V1÷(V1÷V×W) ×D=x÷W×D

5、按细菌/细胞计算：

PTIO自由基清除能力（U/10⁴ cell）=x×V1÷(V1÷V×N) ×D=x÷N×D

6、按液体体积计算：

PTIO自由基清除能力（U /mL）=x×D

V：加入提取液体积，1.0 mL；          V1：反应中样品体积，0.2mL；

N：细胞数量，以万计；                W：样品质量，g。

D：稀释倍数，未稀释即为1。