一、产品简介：

类胡萝卜素(carotenoid)是一类重要的天然色素的总称，普遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类的黄色、橙红色或红色的色素之中。类胡萝卜素是体内维生素 A 的前体，同时还具有抗氧化、免疫调节、抗癌、减轻心血管疾病及着色剂等作用。

植物的类胡萝卜素存在于各种黄色质体或有色质体内；如黄叶，黄色花卉，黄色和红色的果实和黄色块根等组织，样本通过溶剂萃取，分离提取类胡萝卜素，在 440±10nm 处有特殊吸收峰。大部分高等植物和藻类微生物的叶绿体内也含有类胡萝卜素，类胡萝卜素主要吸收蓝紫光，而叶绿素 a 和叶绿素 b 既吸收红光又可吸收蓝紫光。所以针对含叶绿体的组织，为排除叶绿素 a 和叶绿素 b 对类胡萝卜素的干扰，根据经验公式先计算出叶绿素 a 和叶绿素 b 的含量，再进一步得出类胡萝卜素的含量；针对不含叶绿素的组织可以直接根据类胡萝卜素的经验消光系数进行计算。

二、试剂盒组分与配制：

三、需自备的仪器和用品：

酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、锡箔纸、无水乙醇、蒸馏水。

四、操作步骤：

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、预实验样本制备

①取新鲜植物叶片（去掉中脉）或其它绿色组织，用蒸馏水洗干净，然后吸干表面水分，称取约0.1g，剪碎放入研钵或匀浆器中。

②加入1mL提取液，少量试剂一（约50mg），务必在黑暗或弱光条件下充分研磨（难磨叶片可以添加少量石英砂助磨），然后转移至10mL离心管或玻璃试管中。

③用提取液冲洗研钵，将所有冲洗液及研钵中所有的绿色物质转入10mL离心管中，用提取液补充至10mL，玻璃试管置于黑暗条件下或者包上锡箔纸浸提3h，观察试管底部组织残渣完全变白则提取完全，若组织残渣未完全变白，继续浸提至其完全变白。

3、预实验上机操作：

A:黄色或其他非绿色组织（不含叶绿体）类胡萝卜素含量测定步骤：

① 酶标仪预热30min以上，调节波长至440nm。

② 操作表： 

B:新鲜植物叶片或其他绿色组织（含叶绿体）类胡萝卜素含量测定步骤：

① 酶标仪预热 30min 以上，调节多波长至 470nm、649nm 和 665nm。

② 操作表： 

4、正式实验：

① 当测定吸光值超过1.0时，建议将样本用提取液适当稀释后再进行测定，改变后的D代入公式计算；

② 确定好最适实验条件后，正式实验样本制备同预实验样本制备；

③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行。

五、结果计算：

A、黄色或其他非绿色组织（不含叶绿体）类胡萝卜素含量的计算公式：

1、用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下:

类胡萝卜素含量（mg/g 质量）=A440÷（ε×d）×V×1000÷W×D=0.04×A440÷W×D

V：提取液总体积，0.01L；                 1000：单位换算系数，1g=1000mg；

ε：类胡萝卜素经验消光系数，250L/g/cm；      d：比色皿光径，1cm；

D：稀释倍数，未稀释即为1；                W：样本质量，g

2、用 96 孔板测定的计算公式如下:

类胡萝卜素含量（mg/g 质量）=A440÷（ε×d）×V×1000÷W×D=0.08×A440÷W×D

V：提取液总体积，0.01L；                 1000：单位换算系数，1g=1000mg；

ε：类胡萝卜素经验消光系数，250L/g/cm；      d：96孔板光径，0.5cm；

D：稀释倍数，未稀释即为1；                W：样本质量，g

B、新鲜植物叶片或其他绿色组织（含叶绿体）类胡萝卜素含量的计算公式：

1、用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下:

Ca（mg/L）=13.95×ΔA665-6.88×ΔA649

Cb（mg/L）=24.96×ΔA649-7.32×ΔA665

类胡萝卜素浓度：Cc（mg/L）=（1000×ΔA470-2.05×Ca-114.8×Cb）÷245

                          =4.082×ΔA470-0.0084×Ca-0.469×Cb

类胡萝卜素含量（mg/g 质量）=Cc×V×D÷W =0.01×Cc×D÷W

V：提取液体积，0.01L；                D：稀释倍数，未稀释即为1；  

W：样本质量，g。

2、用 96 孔板测定的计算公式如下:

Ca（mg/L）=（13.95×ΔA665-6.88×ΔA649）÷0.5=27.9×ΔA665-13.76×ΔA649

Cb（mg/L）=（24.96×ΔA649-7.32×ΔA665）÷0.5=49.92×ΔA649-14.64×ΔA665

类胡萝卜素浓度：Cc（mg/L）=（1000×ΔA470÷0.5-2.05×Ca-114.8×Cb）÷245

                          =8.163×ΔA470-0.0084×Ca-0.469×Cb

类胡萝卜素含量（mg/g 质量）=Cc×V×D÷W =0.01×Cc×D÷W

V：提取液体积，0.01L；                D：稀释倍数，未稀释即为1；  

0.5: 96孔板光径；                      W：样本质量，g。

注意事项：

1、若不确定组织中有无叶绿素影响，可取样本提取液采用分光光度计在波长 400-700nm下进行扫描，看波长640-670nm之间有无波峰，有波峰则为有叶绿素，反之则无； 

2、为了避免色素见光分解，操作时应尽量避光，研磨或匀浆时应尽量缩短时间；

3、提取液易挥发，操作时做好防护措施。