好久没有更新博文了，有时间的话我还在继续写生物医学重要发现的历史，解析其中的发现逻辑，希望能对研究者有所启发。本文已经被《生命的化学》接收。希望我在积累了有10篇科学发现史后能够集结成书。

抗击癌症的新纪元

             ——CAR-T的前世、今生与未来

金文煜¹，廖新化²*

(¹上海大学钱伟长学院，上海 200444；²上海大学生命科学学院，上海 200444)

摘要：CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-Cell ，嵌合抗原受体T细胞)在血液肿瘤中显示出惊人的疗效，是近年来肿瘤研究最重要的突破之一。CAR-T疗法兼具细胞治疗、基因治疗和免疫治疗，是生物工程设计的经典案例。本文回顾了CAR-T的发展历史，解析其中设计的演化逻辑，并梳理CAR-T面临的挑战以及CAR-T设计相应的调整升级。本文将帮助人们深入理解CAR-T治疗癌症的原理，并对CAR-T所面临的挑战和未来的发展方向有更深刻的认识。

关键词：CAR-T；细胞治疗；免疫疗法；基因治疗；科学史

2012年，年仅7岁的艾米丽急性淋巴细胞白血病二次复发，在接受了几乎所有的常规治疗手段仍旧未果之后，艾米丽的生命面临走向终点。她的双亲决定做最后的尝试，带她前往费城儿童医院，参加了当时只有代号CTL019的细胞疗法的临床试验。医生分离了艾米丽血液中的T细胞，在体外进行遗传改造并扩增后回输到她的体内。幸运的是，虽然在实验初期发生了严重的细胞因子风暴，但是在接受了妥珠单抗对她的免疫系统进行适当抑制之后，艾米丽奇迹般地从白血病中痊愈。一时间，艾米丽的故事登上了全球媒体的头条，伴随着这个幸运孩子走向聚光灯的，还有那个代号为CTL019的疗法，也就是之后2017年美国国家食品药品监督管理局(FDA)正式批准的全球第一个基因治疗方案：瑞士诺华的CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)疗法——Kymriah。Kymriah的批准上市标志着几十年来一直处于实验室和文献中的CAR-T疗法正式通过了临床的检验被投放进入了市场，肿瘤免疫疗法取得了历史性的突破。近年来国内外制药巨头纷纷踏足这一领域，CAR-T相关的新兴公司如雨后春笋般出现，科学家从不同的角度进一步研究和优化CAR-T，相关领域的研究人员乃至公众也渴求对这项新兴技术有进一步的了解。本文着眼于科普需求，深入浅出地解析了CAR-T的设计原理和历史演化逻辑，以求帮助人们从本质上理解现有的纷繁复杂的CAR-T疗法，并更深刻地认识CAR-T所面临的挑战和未来的发展方向。

1 CAR-T的思想源头

时间回溯到100多年前，医生们在长期的实践中注意到肿瘤病人意外感染链球菌会导致肿瘤缩小。之后研究人员有目的地通过感染活的链球菌或者注射热灭活的链球菌来治疗癌症^[1]，在此过程中意识到感染病菌后病人高烧刺激免疫系统是产生疗效所必须的。基于机体免疫和肿瘤的密切关系，20世纪初人们提出了肿瘤免疫监视的理论：肿瘤细胞产生不同于正常细胞的抗原，免疫细胞能识别肿瘤新生抗原并清除肿瘤细胞，这种清除机制有点类似于机体排斥异源的移植物^[2]。1973年前后，科学家开始用骨髓移植来治疗白血病，即病人通过输入免疫细胞杀死肿瘤细胞^[3-5]。在明确了免疫细胞能被肿瘤细胞激活并杀死肿瘤细胞后，Rosenberg和他的团队在1988年将黑色素瘤患者瘤体中浸润的淋巴细胞提取出来并进行体外扩增，这些扩增的淋巴细胞联合白细胞介素-2(用于体内激活扩增免疫细胞)回输入患者的体内可以显著地缩小肿瘤^[6]。在发现了T细胞是杀死肿瘤细胞的主要效应细胞后，人们尝试改造T细胞后输入病人体内以期改变其激活方式以及提高杀灭肿瘤细胞的效率，最终构建出了第一代CAR-T^[7-9]。

2 信号分子替换嵌合：第一代CAR-T设计的原理

要理解CAR-T的工作原理就要从T细胞杀灭肿瘤细胞的原理讲起。肿瘤细胞通过突变或者蛋白表达谱改变后形成区别于正常细胞的肿瘤抗原，肿瘤抗原被抗原呈递细胞(Antigen-presenting cells, APC，APC)吞噬并降解成小肽；部分小肽与组织相容性复合体(Major histocompatibility complex，MHC)相互结合呈递在APC的膜表面；T细胞的MHC受体TCR (T-cell receptor)经重排后形成各种不同的细胞，当某种T细胞的TCR刚好能和呈递在APC细胞表面的MHC-抗原复合体结合后，在共刺激受体/配体(如B7-CD28)的共同作用下，T细胞获得了激活和增殖；而激活的T细胞由于携带识别肿瘤抗原的TCR，就能通过识别肿瘤细胞上MHC呈递的肿瘤抗原杀死肿瘤细胞(图1)。

图1：T细胞激活并杀灭肿瘤细胞的原理

但是，从另一个角度来看，在肿瘤的发生发展过程中，可能会丢掉自身的MHC从而不形成MHC-抗原复合体，以避免自身被T细胞杀死。那么我们可不可以绕过MHC递呈的步骤，直接使T细胞接触到肿瘤细胞的特异抗原，激活并杀死肿瘤细胞呢？

TCR受体是T细胞识别肿瘤抗原、传递信号、激活T细胞杀灭肿瘤细胞的关键蛋白。TCR属于免疫球蛋白家族，它的胞外区结构与抗体的Fab段高度相似。它由a链和b链通过二硫键形成异二聚体。N端和抗体Fab段一样也分为可变区V和恒定区C(图2)。但不同的是，抗体是通过可变区直接和抗原结合的，而TCR的可变区只能结合与MHC形成复合体的抗原。那么这种结合的差别是不是由于二者可变区的不同导致的？换句话来讲，如果把TCR的可变区替换成抗体的可变区，那么TCR是否还具有信号传导的受体功能呢？

图2  TCR和抗体的结构比较

1987年和1989年，日本科学家Yoshikazu Kurosawa团队^[7]和以色列科学家Zelig Eshhar团队^[8]分别构建出了抗体可变区与TCR恒定区的嵌合受体，并证明该嵌合受体能直接接收抗原的刺激信号(图3)。由于抗体重链和轻链的可变区人为偶联后形成的单链抗体(single chain antibody fragment, scFv)和抗体的Fab区一样具有识别抗原的功能(图2)，1993年Zelig Eshhar团队直接将TCR的胞外区替代为抗体scFv；由于TCR激活后与CD3形成非共价复合体并通过CD3z亚基将细胞外信号传导到细胞内，Zelig Eshhar团队大胆地将抗体scFv与CD3z直接融合成一个蛋白质，并证明表达这样融合蛋白的T细胞能传导信号、分泌IL-2并在体外杀死表达特定抗原的淋巴瘤细胞^[9]。就此，第一代CAR-T诞生了(图3)。这项巨大的发现使科研人员迫不及待地将其运用在了临床试验上，然而结果却不如预期那么好，第一代CAR-T的信号传导效率低下，并且回输体内活化的时间和存在的寿命较短^[10]，使它成为了多篇报告中的“效果并不显著但是具有巨大潜力”的一种治疗手段。

图3 第一代至第四代CAR-T的结构

3 协同分子的加入：第二至第四代CAR-T

第一代CAR-T在多次的临床试验中表现得并不尽如人意，唯一的安慰是它确实在临床试验的初期表现出了一定的作用，这一点预示了现有的CAR-T细胞确实起到了绕开MHC直接进攻癌细胞的作用，但是是什么问题导致了它的“短寿”呢？

如前所述，T细胞被APC细胞或者肿瘤细胞完全激活除了TCR与MHC-抗原复合物结合外，还需要共刺激受体/配体的共同作用。这是免疫系统为了预防错杀正常细胞采用的双保险策略。因而第一代CAR-T失败的最重要原因在于细胞识别肿瘤细胞后没有办法完全活化。了解到问题所在后，科学家在第一代嵌合受体的基础上又增加了一个共刺激信号分子CD28的胞内区(或者其它共刺激信号分子如4-1BB、OX40、CD27)，使改造后的T细胞也能够像正常的T细胞一样在双信号转导的帮助下更好地靶向杀伤癌细胞，这就是第二代CAR-T ^[11-12](图3)。第二代CAR-T基本确定了CAR-T的基础结构，它同时满足了通过抗原抗体的高特异性识别肿瘤以及识别后高效活化T细胞两个特性。同时，它在治疗难治性白血病的临床试验上也大放异彩，使一大批常规疗法已然无效的白血病患者实现了完全康复的奇迹。

考虑到第二代CAR-T的成功有赖于加入了能够活化T细胞的共刺激分子，那么，是否可以在嵌合受体中继续增加共刺激分子，从而达到更好的效果呢？第三代CAR-T就是在CD28共刺激分子的基础上又串联了一个共刺激分子(4-1BB或者OX40)来加强信号传导的效率^[13](图3)。这个看似合理的想法也受到了质疑——Moffitt团队报道第二代CAR-T比第三代CAR-T反而有更好的信号传导作用。

第二代CAR-T在血液肿瘤中大放异彩，但是在实体瘤中却作用有限。众多的研究提示肿瘤微环境中存在抑制CAR-T作用的因素。第四代CAR-T是在第二代的基础上引入了新的信号转导元件，使嵌合受体在肿瘤抗原刺激下释放大量的细胞因子，通过细胞因子来克服肿瘤微环境的免疫抑制作用(图3)。这个想法在细胞层面得到了验证，但是还需要临床试验进一步证实^[14]。       

4 致命的细胞因子风暴

CAR-T疗法也具有副作用，其中最为致命的是细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome, CRS)。在第三代CAR-T的临床试验中，一位结肠癌晚期合并肝、肺转移的患者在接受了CAR-T治疗的五天后，由于严重的CRS不幸去世^[15]。FDA因此在当时限制了CAR-T的临床试验。

细胞因子释放综合征也称细胞因子风暴(cytokine storm)，当有病原体侵入到人体内部时，会激活免疫细胞进攻这些侵入者，同时免疫细胞会释放一些细胞因子(如干扰素、白细胞介素IL、趋化因子、肿瘤坏死因子等)协助进攻，释放出的细胞因子反过来会召集更多的免疫细胞，形成循环放大的效应。一般情况下，随着侵入者被逐渐消灭，释放出的细胞因子也会逐渐减弱，但是在一些特殊情况下，比如大量输注CAR-T时，免疫系统被过度激活，瞬间大量释放出的细胞因子会导致免疫细胞无差别攻击自身细胞从而引起严重的炎症反应和多处器官衰竭^[16]。CAR-T引起的CRS的核心细胞因子包括IL-1、IL-6、IL-10以及IFN-γ等。临床上通过妥珠单抗阻滞IL-1以及IL-6的释放能够有效地减轻CRS对人体的危害^[17]。CAR-T引起的CRS由巨噬细胞释放儿茶酚胺介导，科学家研究发现心脏细胞释放的心钠肽具有抑制儿茶酚胺释放的作用。在靶向CD19抗原的CAR-T的模型小鼠中注射心钠肽，以及另一种儿茶酚胺合成抑制剂α-甲基酪氨酸，发现它们不仅降低了细胞因子的全身释放，还不影响CAR-T细胞的功效^[18]。随着研究的不断拓展和深入，人们将会有越来越多的手段来管控CRS这一棘手的副作用。

5 肿瘤复发

CAR-T治疗血液肿瘤非常有效，但是复发的现象并不罕见。在宾夕法尼亚大学领导的一项靶向CD19的CAR-T的临床一期试验中，一名20岁的白血病患者在接受治疗后得到了极大的缓解，但是九个月后复发并死亡。一开始，研究人员发现，该病例就和一般的复发病例一样，患者的癌细胞几乎不表达CD19，似乎是一起非常常见的复发类型。但是之后，研究人员突然发现，该名患者的癌细胞居然表达CAR蛋白。原本应该在T细胞表达的CAR在癌细胞上表达，使得癌细胞上应该被靶向的CD19丢失，创造出了CAR-T完全无能为力的CAR-癌细胞^[19]。在经过回溯研究后发现这一切起源于CAR-T制作过程中混入了白血病B细胞，从而使白血病B细胞和T细胞一样携带了CAR蛋白。

在一项针对CD19的CAR-T的动物研究中，科研人员发现带有荧光标记的CD19出现在了CAR-T细胞的表面。究其原因是免疫细胞具有胞啃作用(trogocytosis)，即吞噬靶细胞的细胞膜。癌细胞利用这个作用将自身的CD19转移给T细胞，降低CD19的表达以逃避T细胞的进攻；另一方面，由于T细胞本身携带了肿瘤抗原CD19，导致T细胞互相攻击耗竭^[20](图4)。 

图4 癌细胞通过胞啃作用将抗原转移到T细胞表面

CAR-T治疗后复发病例的一个主要特征是多种原因的抗原丢失，使CAR-T细胞虽然在扩增，但是却找不到可以靶向的抗原，无法起到监管的作用。现在主流的解决方案是双靶点CAR-T，双靶点提供了除基础靶点之外的另外一个靶点，使得即使出现单一抗原表达较低的癌细胞，CAR-T也能够快速地进行识别和杀灭。比如同时靶向CD33和CD123的用以治疗急性淋巴白血病的疗法在临床上就已经取得了较好的效果^[21]。

6 实体瘤困境

CAR-T在血液肿瘤领域中强有力的治疗能力有目共睹， 2019年人们统计已经报道的临床试验数据发现约80%的血液肿瘤患者经过CAR-T治疗后可以获得完全缓解［5］。然而，在实体瘤的临床治疗中，CAＲ-T 细胞的表现却相去甚远，总缓解率仅约9%［6］。而在2019年发布的中国癌症报告显示，血液肿瘤的死亡率仅占全部癌症的2.31%。因而实体瘤到现在仍旧是CAR-T跨不过去的坎。

那么实体瘤和血液肿瘤的差别是什么？

首先，实体瘤和血液肿瘤的区别之一是，相较于血液肿瘤能够表达较特异的靶抗原(如CD19)，实体瘤表达的肿瘤相关抗原在正常细胞中同样会低水平表达^[22]。因而使用这些抗原作为CAR-T的靶标具有命中但靶向非肿瘤细胞的效应(on-target off tumor effects)，会杀死正常组织中低表达抗原的细胞，导致严重的副作用。解决的办法之一是降低CAR-T的亲和力，比如把微摩尔抗原亲和力的CAR调整为纳摩尔亲和力的CAR，使其主要作用于实体瘤而不是低表达抗原的正常组织，降低毒性^[23]。另外，可以利用“与(and)”和“否（No)”的逻辑门设计CAR。如有研究团队将CAR-T胞内的活化信号和协同刺激信号进行拆分，分别连接识别两个不同抗原的单链抗体，这样CAR-T细胞只有识别到同时表达这两种抗原的肿瘤细胞时才能充分激活；有的团队则引入一个能识别正常细胞表面分子并引发抑制性信号的CAR，由此避免CAR-T细胞在正常组织部位被激活^[24-25]。

实体瘤和血液肿瘤的第二个区别是许多实体瘤内部会有不同类型的肿瘤细胞即异质性；这些细胞相互之间携带的抗原以及表达水平都有所不同，如果CAR-T仅对部分肿瘤细胞有效，治疗就很难成功。人们尝试用“或(or)”的逻辑门来设计CAR-T，以更广谱地靶向多种抗原，但是伴随而来的挑战是可能更大的命中但靶向非肿瘤细胞的副作用^[22,25]。

实体瘤和血液肿瘤的第三个区别是血液肿瘤细胞是分散的，而实体瘤通常会形成致密的团状物，肿瘤内间质压也异常升高，成为阻挡CAR-T细胞浸润的物理屏障。解决的办法是进一步改造CAR-T，比如表达特定的趋化因子受体增加CAR-T向肿瘤组织迁移，表达一些能攻击肿瘤基质细胞或者降解肿瘤细胞外基质的蛋白质以降低CAR-T浸润肿瘤组织的障碍等^[22,26-27]。

其四，肿瘤细胞适应了瘤内弱酸性、低氧、缺乏营养的特殊微环境，但是这种环境非常不利于CAR-T细胞生存；此外肿瘤微环境还有大量不利于CAR-T细胞生存的抑制因子和抑制细胞^[28]。解决的办法除了之前提到的在第四代CAR-T中引入能释放改善微环境的细胞因子元件外，还可以通过CAR-T与其它药物联合治疗，克服肿瘤的免疫抑制作用，提高浸润到实体瘤内部CAR-T的活性^[22,27,29]。此外，T细胞本身存在负反馈机制，目前有很多临床前和临床研究尝试通过敲除/抑制T细胞活性的负反馈因子(CTLA-4、PD-1、LAG3等)来增强CAR-T治疗实体瘤的疗效^{[22,25,30-32]}。

7 高成本的解决之道：通用CAR-T

Kymriah在美国的费用为每名患者47.5万美元，这个价格对于任何国家的普通家庭来说都难以承受。高价背后的原因不仅仅是CAR-T作为一种全新的治疗手段有着高昂的研发成本，而且是因为CAR-T需要根据患者的个体差异进行定制和制备，它不是一种药物，而更像是以一种个性化的医疗服务在出售。

为了改变CAR-T疗法高昂的价格，以及突破其必须现取现用现培养的局限性，科学家提出了通用CAR-T的概念。现阶段，通用CAR-T有两个研发策略：通用的T细胞与通用的CAR。

由于从患者或者健康供体中提取的天然T细胞带有特有的TCR基因和HLA Ⅰ类基因座(即前述人的MHC)，它们移植入异体后会引起严重的移植物抗宿主病(即移植的免疫细胞攻击宿主的正常细胞)。那么如果利用基因编辑技术将CAR-T细胞中的TCR基因与HLAⅠ类基因座敲除，就有可能实现将提前准备好的CAR-T细胞进行快速的异体移植^[33]。其中，使用TALENs技术编辑的T细胞已经进行了临床试验且表现良好^[34]，而另外使用CRISPR/Cas9进行编辑的CAR-T治疗方法也正在进行临床测试。

市场上的CAR-T细胞靶向的都是单一的抗原，这一方面导致了治疗高异质性实体瘤无效，另一方面靶向单一抗原可能导致治疗后引起抗原丢失而使病情复发。通用CAR就是在设计上将嵌合受体拆解成识别抗原的scFv和介导信号转导的胞内区，然后将两者分别融合生物素和亲和素^[35]，或者亮氨酸拉链(leucine zipper)的两个肽链^[36]，利用生物素-亲和素或者亮氨酸拉链的高亲和性重新形成二聚体，从而实现嵌合受体的完整功能。经过拆分后，CAR-T细胞都表达一样的介导信号转导的胞内区，而识别抗原的部分可以根据肿瘤细胞的不同抗原进行添加，这样就增加了CAR-T的灵活性和可适配性(图5)。

图5  通用CAR的设计原理

8 展望

1930年，瑞士的保罗·尼汉斯成功地使用羊胚胎素活细胞治疗皮肤老化，拉开了细胞治疗的新纪元。时至今日，除了CAR-T外，在肿瘤领域还有CIK细胞免疫治疗、NK细胞免疫治疗、ACTL细胞免疫治疗、TCR-T等细胞治疗手段。CAR-T疗法已经在急性淋巴白血病上取得了非常大的成就与突破，它同PD-1、CTLA-4抗体等一起开启了肿瘤免疫治疗的新纪元。虽然CAR-T在靶标的选择、副作用、临床上实体瘤的攻克等方面还面临着巨大的挑战，但是随着科学家不停的探索，对T细胞杀伤肿瘤机制的进一步理解，CAR-T不断升级换代，CAR-T和其它疗法联合使用的尝试等，可以预期CAR-T在未来会带来肿瘤治疗新的突破，将癌症变成一种慢性病的口号未来也一定会变成现实。

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